一种紫杉醇菌株的筛选方法及其半定量分析技术

本发明专利技术公布了一种紫杉醇菌株的筛选方法及其半定量分析，属于微生物发酵产物的测定与检验方法技术领域，包括紫杉醇标准溶液的配制、真菌发酵与薄层层析、紫杉醇菌株的筛选与半定量分析方法等。称取紫杉醇标准品2mg，溶解于10mL三氯甲烷，配制成0.2mg/mL标准溶液；分离红豆杉内生真菌纯培养物进行液体发酵；对发酵液的滤液萃取后收集有机相，获得内生真菌发酵液的萃取物；将标准紫杉醇溶液或真菌发酵产物的萃取物进行薄层层析与显色反应；根据显色反应结果可以从红豆杉内生真菌中筛选到紫杉醇菌株并对菌株的紫杉醇产量进行半定量分析。本发明专利技术重现性较好，灵敏度较高，专一性较强，筛选效率较高，与高效液相色谱等分析方法相比较具有更低的设备和技术要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种紫杉醇菌株的筛选方法及其半定量分析，属于微生物发酵产物的测定与检验方法

技术介绍
紫杉醇(Taxol)为二萜类化合物，具有较为独特的抗肿瘤机制，通过影响微管蛋白的稳定来抑制肿瘤细胞的分裂和增殖。但是紫杉醇作为重要的天然抗癌药物，药源问题一直未得到有效解决。直到现在，商业用紫杉醇主要提取自红豆杉属植物的树皮，红豆杉是世界性的濒危珍稀植物，而且紫杉醇在红豆杉树皮内的含量极低，结果导致紫杉醇的供需矛盾突出。为了在不破会自然资源的情况下有效解决紫杉醇的药源问题，各国学者主要从三个方面开展研究工作。 一是紫杉醇的化学合成。尽管全合成或半合成紫杉醇的研究均已经取得积极进展，但是合成步骤太多，合成条件难以控制，产物收率偏低，并不适于工业化生产； 二是红豆杉的组织培养和细胞培养。期望通过生物反应器实现大规模培养并最终获取目的产物，但是红豆杉细胞容易褐化、培养物生物量小，培养规模小、紫杉醇产率较低和生产稳定性差等问题并没有得到彻底解决，距离真正实现紫杉醇工业化生产还有距离； 第三个是真菌发酵，通过微生物发酵的方法生产紫杉醇开创了解决紫杉醇药源问题的新思路。由于真菌生长迅速、容易培养、发酵技术相当成熟，未来通过真菌发酵解决紫杉醇的药源问题无疑是最诱人的办法和途径。目前面临的最大问题，就是菌株的紫杉醇生产能力与发酵生产的要求还有很大距离；尽管紫杉醇产生菌株具有广泛的多样性，但是当务之急还是从红豆杉植物中大量筛查内生真菌，获得优良的紫杉醇产生菌株，为紫杉醇的发酵生产提供丰富的真菌资源。薄层层析法是一种微量、快速而简单的色谱方法，兼具柱色谱和纸色谱等分析方法的优点，广泛应用于发酵产物、环境化学、高分子材料以及石油化工等
借助薄层层析显色反应，建立成熟的紫杉醇产生菌株的快速筛选方法、并对菌株的紫杉醇生产能力进行半定量分析具有积极意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重现性好、灵敏度高、可以从红豆杉内生真菌中筛选到紫杉醇菌株并对紫杉醇菌株产量进行半定量分析。实现本专利技术目的采取的技术方案如下 (I)真菌发酵产物的制备选取若干红豆杉植物的组织块进行表面消毒，分离内生真菌纯培养物；将得到的菌株充分活化，转接入50mL种子培养基，220C、130 rpm/min,恒温振荡培养3天获得发酵种子；以20% (体积比)接种量，转接IOOmL发酵培养基，22°C，110 rpm/min，恒温振荡培养15天后完成发酵；过滤内生真菌的发酵产物,滤液用等体积的氯仿_甲醇液(10/1，体积比)萃取2次，收集有机相，即真菌发酵产物的萃取物；(2)紫杉醇标准溶液的配制称取紫杉醇标准品2mg，溶解于IOmL三氯甲烷，配制成0.2mg/mL标准溶液； (3)薄层层析与显色反应称取IOg硅胶，加入无菌蒸馏水后充分搅匀，湿法铺板，110°C烘干活化0.5小时，制成硅胶板，置于干燥器内备用；层析时，点样于硅胶板上，使用氯仿-甲醇液(7/1，体积比)作为展开剂直立上行展开，层析完成后将层析板取出挥干，使用含有l_3wt%香草醛的浓硫酸液喷雾显色； (4)紫杉醇菌株的筛选将步骤(I)得到的真菌发酵产物的萃取物和步骤(2)的紫杉醇标准溶液同时点样于硅胶板上的不同位置，在展开缸内进行如步骤(3)中薄层层析和显色反应，萃取物在层析板上如果形成与标准溶液迁移率(R f)相同的蓝色斑点，即确认该内生真菌可以产生紫杉醇； (5)真菌菌株紫杉醇产量的半定量分析将步骤(2)配制好的0.2 mg/mL紫杉醇标准溶液，使用微量进样器分别吸取5、25、45、65、85 ML,点样于娃胶板上,在展开缸内进行如步骤(3)中薄层层析和显色反应，由于点样的标准液中紫杉醇含量不同，显色后形成的蓝色斑点深浅不同；将分离的紫杉醇菌株进行如步骤(3)中薄层层析和显色反应，根据蓝色斑点的深浅变化，对比标准溶液形成的蓝色斑点，可以实现对菌株的紫杉醇产量进行半定量分析。本专利技术进一步的设置如下 步骤I中所述的分离红豆杉内生真菌的方法为将植物组织块连续浸入75% (体积比)乙醇中I分钟，3. 25wt%次氯酸钠中5分钟，75% (体积比)乙醇中30秒钟，然后用无菌滤纸吸干，将处理后的组织块放在加有链霉素(30mg/L)的PDA (马铃薯琼脂培养基)平板上，封口后25°C恒温培养2个月，通过尖端菌丝挑取法将菌落转移到PDA斜面保存。步骤I中所述的种子培养基和发酵培养基为改良的马丁氏液体培养基。步骤I中所述的改良的马丁氏液体培养基成分为葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L、KH2PO4 lg/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，苯丙氨酸 2.8mg/L，苯甲酸钠 30mg/L，乙酸钠 lg/L, pH为 5. 5-6. O。步骤3中所述的浓硫酸液中香草醛的含量为lwt%。本专利技术中，紫杉醇标准品购自Sigma公司，粉末状，纯度99. 99% ;香草醛为显色剂，即3-甲氧基-4-羟基苯甲醛；迁移率(Rf)是指薄层层析时，真菌发酵液萃取物中的物质或者标准品中的紫杉醇在层析板上沿着溶剂方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比。附图说明图I使用含有香草醛的浓硫酸液喷雾显色后，不同含量的紫杉醇标准品在硅胶板上形成的蓝色特征性斑点； 图2为不同菌株发酵液萃取物通过薄层层析显色反应形成的特征性斑点图。斑点A-E代表的紫杉醇的含量分别为1、5、9、13、17 Mg ;1、样品一 ；2、样品二 ；3、样品三；4、标准溶液；5、样品五。具体实施方式实施例(I)称取粉末状、纯度99. 99%的紫杉醇标准品2mg，溶解于IOmL三氯甲烷，配制成0. 2 mg/mL忙液，作为标准溶液； (2)采集红豆杉植物样本，选取若干植物组织块，将植物组织块依次并连续浸入75%(体积比)乙醇中I分钟，3. 25wt%次氯酸钠中5分钟，75% (体积比)乙醇中30秒钟，表面消毒后用无菌滤纸吸干，将处理后的组织块放在加有链霉素(30mg/L)的PDA (马铃薯琼脂培养基)平板上，封口后25°C恒温培养2个月。通过尖端菌丝挑取法将菌落转移到PDA斜面保存，分离获得内生真菌纯培养物。将得到的菌株充分活化后，转接入50mL种子培养基，在220C、130rpm/min条件下,恒温振荡培养3天，获得发酵种子，以20% (体积比)接种量,转接到IOOmL发酵培养基中，在22°C、110rpm/min条件下，恒温振荡培养15天，完成发酵，过滤发酵液，滤液用等体积的氯仿-甲醇液(氯仿-甲醇液的体积比为10 1)萃取2次，收集有机相萃取物，低温干燥，即获得内生真菌发酵物的萃取物； 其中，内生真菌的种子培养基和发酵培养基为改良的马丁氏液体培养基，改良的马丁氏液体培养基成分为葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L、KH2PO4 lg/L, MgSO4 7H20 0. 5g/L，苯丙氨酸2.8mg/L,苯甲酸钠30mg/L,乙酸钠lg/L, pH为5. 5-6. 0 ; (3)使用微量进样器分别吸取步骤(I)的紫杉醇标准液5、25、45、65、85ML，点样于硅胶板上，在展开缸内使用氯仿-甲醇液(氯仿-甲醇液的体积比为7 1)作为展开剂直立上行展开，进行薄层层析，层析完成后取出挥干，使用含有lwt%香草醛的浓硫酸液喷雾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种紫杉醇菌株的筛选方法及其半定量分析，包括紫杉醇标准溶液的配制、真菌发酵产物的制备，其特征在于：还包括薄层层析与显色反应、紫杉醇菌株的筛选和菌株紫杉醇产量的半定量分析，（1）真菌发酵产物的制备：选取若干红豆杉植物的组织块进行表面消毒，分离内生真菌纯培养物；将得到的菌株充分活化，转接入50mL种子培养基，22℃、130？rpm/min，恒温振荡培养3天获得发酵种子；以20%（体积比）接种量，转接100mL发酵培养基，22℃，110？rpm/min，恒温振荡培养15天后完成发酵；过滤内生真菌的发酵产物，滤液用等体积的氯仿？甲醇液(10/1，体积比)萃取2次，收集有机相，即真菌发酵产物的萃取物；（2）紫杉醇标准溶液的配制：称取紫杉醇标准品2mg，溶解于10mL三氯甲烷，配制成0.2？mg/mL标准溶液；（3）薄层层析与显色反应：称取10g硅胶，加入无菌蒸馏水后充分搅匀，湿法铺板，110℃烘干活化0.5？小时，制成硅胶板，置于干燥器内备用；层析时，点样于硅胶板上，使用氯仿？甲醇液(7/1，体积比)作为展开剂直立上行展开，层析完成后将层析板取出稍微挥干，使用含有1？3wt%香草醛的浓硫酸液喷雾显色；（4）紫杉醇菌株的筛选：将步骤（1）得到的真菌发酵产物的萃取物和步骤（2）的紫杉醇标准溶液同时点样于硅胶板，在展开缸内进行如步骤（3）中薄层层析和显色反应，萃取物在层析板上如果形成与标准溶液迁移率(Rf)相同的蓝色斑点，即确认为该内生真菌可以产生紫杉醇；（5）真菌菌株紫杉醇产量的半定量分析：将步骤（2）配制好的0.2？mg/mL紫杉醇标准溶液，使用微量进样器分别吸取5、25、45、65、85？μL，点样于硅胶板上，在展开缸内进行如步骤（3）中薄层层析和显色反应，形成深浅不同的蓝色斑点。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：臧威，孙剑秋，范呈浪，尹军霞，沈国娟，
申请(专利权)人：绍兴文理学院，
类型：发明
国别省市：