检测由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法技术

检测由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法包括：用蛋白质染色剂对试验血清、血浆或血液或者经纯化的抗体进行染色；将具有染色的抗体的血清、血浆或血液与等量的着色的在玻璃玻片上的抗原颗粒进行混合；向所述混合物中添加与生物素缀合的经稀释的抗球蛋白；对混合物进行混合步骤；向混合物中添加经稀释的亲和素（优选地用可见指示剂进行标记），并将所有成分充分混合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。本专利技术还涉及高灵敏的凝集试验，称为“超凝集试验”，用于诊断由多种微生物引起的感染，并且避免在使用常规凝集试验通常产生的假阳性和假阴性结果。
技术介绍
凝集试验能够用作测定抗原或抗体存在的定性试验，或者用作测量针对特定抗原的抗体水平的定量试验。快速平板试验(Rapid PlateTest, RPT)或平板凝集试验(Plate Agglutination Test, PAT) / 玻片凝集试验(Slide Agglutination Test, SAT)是用于检测针对血清中微生物的抗体的筛选试验。阳性血清样品进行试管凝集实验(TubeAgglutination Test,TAT)用于进一步验证和对抗体滴度的定量。在定量试验中，制 备待针对抗体进行试验的血清样品的系列稀释物，并随后添加固定量的颗粒抗原。产生可见凝集反应的最大稀释度被称作滴度。凝集反应的强度是血清中抗体浓度的最好指示。非常低浓度的抗体不产生可见的凝集反应。在高浓度的抗原或抗体缺少凝集反应被称作前带效应(Prozone effect)。在前带中形成非常少的复合物,其不聚集而形成可见的凝集反应。这些因素也导致假阴性结果。在许多国家，标准的平板凝集试验是用于人布鲁杆菌病的常规试验。然而，其会产生假阴性结果(WHO报告，1986 ;Lucero和Bolpe, 1998)。玫瑰红平板试验(Rose BengalPlate Test, RBPT)是平板/玻片凝集试验的变体，其中用玫瑰红染料染色的杀死的布鲁杆菌属(Brucella)微生物用作检测血清中抗体的抗原。国际兽疫组织(TheInternationalOffice of Epizootics)推荐将RBPT作为诊断牛布鲁杆菌病诊断的一种试验(Corbel和MacMillan，1995)。RBPT是用于诊断布鲁杆菌病的快速、廉价和有效的试验。其可以使用最低限度的设备进行，并且最终结果通过裸眼读取。然而，有许多因素影响RBPT反应及其读取结果。有些人能够看出较细小的凝集反应，而许多其他人不行。这导致了结果的多变。一些作者(Saravi等人，1990)报道了使用RBPT产生假阴性的不可接受的比例。当用于对来自低患病率群/组中动物的血清进行试验时，从不同来源获得的RBPT抗原的灵敏度也变化很大(Blasco等人，1994)。常规凝集试验是用于诊断感染性疾病的简单廉价方法。然而与其他血清学试验例如ELISA、Western印记等相比，其具有较低的灵敏度及因此更高几率的假阴性结果。早期增强凝集反应的尝试开发出了非直接库姆斯氏试验(Indirect Coombs’ Test)和共凝集试验(Coagglutination Test)。使用抗球蛋白的非直接库姆斯氏试验已经用于血清抗体的交联以产生凝集的更大团块(clump)而易于检测。然而，抗球蛋白单独与抗球蛋白的疏松末端形成抗体的扩散网，这用肉眼很难检测。共凝集是用于筛选和快速诊断感染性疾病的灵敏试验。然而，其需要以非特异性方式结合免疫球蛋白的蛋白质A，并是昂贵的且制备方法复杂。此外，由于不能区分单独抗原颗粒的非特异性凝集和抗原与抗体结合形成的特异性凝集，库姆斯氏抗球蛋白试验和共凝集试验两者都可能产生假阳性结果。目前可用诊断试验的局限性包括a)可用凝集试验和基于其的试剂盒具有较低灵敏度和更高几率的假阴性结果。b)不能区分不恰当混合形成的颗粒抗原的非特异性凝集和抗原与抗体的特异性凝集，从而在常规凝集试验中产生假阳性结果。c)使用抗球蛋白的非直接库姆斯氏试验已经用于血清抗体的交联以产生凝集的更大团块而易于检测。然而，抗球蛋白单独与抗体结合抗球蛋白的疏松末端形成抗原-抗体团块的广泛扩散网，而用肉眼很难检测。d)共凝集试验依赖蛋白质A，其是昂贵的并非特异性地结合免疫球蛋白。e)由于不能区分单独抗原颗粒的非特异性凝集和抗原与抗体结合形成的特异性凝集，库姆斯氏抗球蛋白试验和共凝集试验两者都可能产生假阳性结果。f) ELISA和Western印记需要受训的技术人员以及配置良好的实验室，而这在发 展中国家比较少。基于这些测定法的试剂盒是昂贵的。g)分子诊断技术只能由训练良好的技术人员在配置良好的实验室中进行，这在发展中国家比较少。基于这些测定法的商用试剂盒是昂贵的。专利技术目的本专利技术的一个目的是提供检测由多种由微生物所弓I起感染的凝集反应的改良方法。本专利技术的另一个目的是提供开发用于感染性疾病的非常灵敏、特异性、廉价并易于使用的诊断测定法和基于其的诊断试剂盒的方法。本专利技术的另一个目的是提供用于准确诊断以及用于快速筛选和监测大量感染性疾病的方法。另外，本专利技术的目的还在于提供开发可靠凝集试验以消除常规凝集试验通常具有的假阳性结果的可能性的方法。本专利技术的再另一个目的是提供开发可靠凝集试验以消除常规凝集试验通常具有的假阴性结果的可能性的方法。本专利技术还有一个目的是提供诊断方法和基于其的诊断试剂盒，其是penside方式并且其结果易于通过肉眼检测。专利技术简述包括用蛋白质染色剂对试验血清、血浆或血液或者经纯化的抗体进行染色；将具有染色的抗体的血清、血浆或血液与等量的着色的在玻璃玻片上的抗原颗粒进行混合；向所述混合物中添加与生物素缀合的经稀释的抗球蛋白；对混合物进行混合步骤；向混合物中添加经稀释的亲和素(优选地用可见指示剂进行标记)，并将所有成分充分混合。附图说明图A.使用抗原(Ag)和阳性血清(Ab)的常规凝集。图B.使用IgG和IgM抗球蛋白(AG)的增强凝集。图C.使用生物素化的抗球蛋白(bAG)和亲和素(Av)的超凝集。图I.由抗原和阳性血清引起的正常凝集。图2.使用染色的抗体、生物素化的抗球蛋白和亲和素的超凝集(宏观)。图3.超凝集(微观)专利技术详述颗粒抗原与抗体的反应产生抗原的聚集，这称为凝集反应。凝集测试通过显示血清、血浆或血液中针对感染性微生物的抗原的抗体存在，用在感染的诊断中。凝集试验只在使用颗粒抗原中有效。然而，可以用可溶性抗原(例如病毒抗原)包被颗粒例如乳胶珠，并将经包被的颗粒用在凝集试验中以检测针对所述可溶性抗原的抗体。在乳胶凝集试验(LatexAgglutination Test)中，将用抗原包被的显微乳胶珠的悬浮液与血清、血衆或全血样品混 合。如果样品中存在抗体，它们将与珠上的抗原结合，引起它们凝集或聚集。这种聚集可以可视地进行检测。凝集试验非常迅速，因为与使用基于其他试验的试剂盒需要几个小时来显示结果相比，其可以在5分钟内检测抗体。凝集试验是用于诊断感染性疾病的简单廉价方法。然而与其他血清学试验例如ELISA、Western印记等相比，其具有较低的灵敏度及因此更高几率的假阴性结果。早期增强凝集反应的尝试开发出了非直接库姆斯氏试验(也称为库姆斯氏抗球蛋白试验，Coombs’Antiglobulin Test)和共凝集试验(Coagglutination Test)。然而，库姆斯氏抗球蛋白试验由于抗球蛋白Fe区的松散末端而具有形成更大抗原-抗体团块网的局限。共凝集是用于筛选和快速诊断感染性疾病的灵敏试验。然而，其需要以非特异性方式结合免疫球蛋白的蛋白质A，并是昂贵的且制备方法复杂。此外，由于不能区分单独抗原颗粒的非特异性凝集和抗原与抗体结合形成的特异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.09.30 IN 1345/DEL/091.检测由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法，其包括 用蛋白质染色剂对试验血清、血浆或血液或者经纯化的抗体进行染色； 将具有染色的抗体的血清、血浆或血液与等量的着色的在玻璃玻片上的抗原颗粒进行混合； 向所述混合物中添加与生物素缀合的经稀释的抗球蛋白； 对混合物进行混合步骤； 向混合物中添加经稀释的亲和素(优选地用可见指示剂进行标记)，并将所有成分充分混合。2.权利要求I的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·M·萨克塞纳，
申请(专利权)人：生物技术部，安格德·德夫·古鲁兽医和动物科学大学，
类型：发明
国别省市：