本发明专利技术提供一种编码β-胡萝卜素羟化酶的SEQ?ID?NO.5所示的DNA序列、该DNA序列与编码β-胡萝卜素酮化酶的SEQ?ID?NO.6所示的DNA序列以及质粒所构建的重组表达载体、经上述重组表达载体转化的宿主细胞；本发明专利技术还提供一种使苹果树合成虾青素提高其抗光氧化能力的方法，所述的方法包括以下步骤：a)构建重组表达载体pCAMBIA1301-bkt-crtR-B；b)重组表达载体pCAMBIA1301-bkt-crtR-B转化感受态农杆菌EHA105；c)农杆菌转化苹果组培苗获得转基因植株。本发明专利技术通过遗传转化，将虾青素合成关键酶基因bkt和crtR-B转入苹果基因组中，通过调控代谢途径培育出富含虾青素的苹果，从而提高其光合效率、预防日烧的发生，从根本上克服了现有技术的缺点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体地说，是一种通过植物遗传转化方法使苹果树合成虾青素提高其抗光氧化能力的方法。
技术介绍
苹果树在高温强光的生长季节很容易遭受光氧化损伤，表现为两方面，一方面，叶片在进行光合作用时会因光氧化损伤而导致光合效率降低；另一方面，苹果果实则常出现日烧现象，通常苹果日烧是由于果实在温度逆境和强光下发生的光氧化伤害所致，每年在世界苹果产区都不同程度的有所发生，一旦发病，会严重降低果品的产量与品质，给生产造成很大损失。随着矮化栽培制度的普及和全球气候变暖，苹果日烧有逐年加重的趋势。黄 色(金冠等)、绿色(澳洲青苹)和晚熟红色品种(红富士等)常因高温强光季节抗氧化能力较低而容易发生日烧。针对叶片因光氧化损伤而导致光合效率降低，目前生产上尚没有有效的专门提高果树叶片抗光氧化能力的预防方法。针对苹果果实日烧，目前国内采取的措施主要有两种，一是综合防治，即加强果园栽培管理、合理负载量、叶幕微气候和增强树势等，二是果实套袋技术，即在花后4-6周左右对幼果套袋，等到果实采收前2-4周把袋摘掉，让果实上色，避免在高温强光期果实直接暴露于强光下，从而防止日烧；国外发达国家对苹果日烧的主要预防技术包括喷水、遮阴、喷布保护膜等，其中最有效的是喷水，最先进的是在果园的典型位置，在果面安装温度感应器，并且与自动喷水系统相连，当高温强光天气果面温度升高到一定温度时，自动喷水系统就启动喷水，对果面降温，从而达到防止日烧的目的。但目前生产上建议的综合防治技术和果实套袋技术都有明显的缺点。前者难以掌握，通常达不到效果；果实套袋技术如果操作得当，通常可以有效地防止日烧，但是，生产上如果摘袋时间不合适，或遇上不利天气，可能导致更为严重的日烧，另外，套袋费工费时，随着劳动力价格的快速上升，套袋成本太高，将越来越难以实施。国外的喷水预防苹果日烧技术在许多地方不具备喷水条件，难以实施。虾青素(Astaxanthin)是一种氧化型酮式红色类胡萝卜素，具有很强的抗光氧化能力，能够淬灭由光氧化产生的多种活性氧，防止活性氧对细胞的伤害。有研究表明，虾青素抗氧化活性是维生素E的550倍，是￠-胡萝卜素、玉米黄素等类胡萝卜素的10倍，被誉为“超级维生素E”、“超级抗氧化剂”。而苹果体内类胡萝卜素代谢途径中不能合成虾青素，但富含虾青素合成的前体物质￠-胡萝卜素。虾青素合成关键酶￠-胡萝卜素酮化酶(BKT)和￠-胡萝卜素羟化酶(CRTR-B)能够共同作用转化玉米黄素、P _胡萝卜素形成虾青素。目前，利用虾青素关键酶合成基因转化苹果，提高苹果果实和叶片的抗光氧化能力方面的研究在国内外尚未见报导。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种编码￠-胡萝卜素羟化酶的DNA序列。本专利技术的再一的目的是提供一种重组表达载体。本专利技术的另一的目的是提供一种基因工程化的宿主细胞。本专利技术的第四个目的是提供。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是一种编码￠-胡萝卜素羟化酶的DNA序列，所述的DNA序列包括a) SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列，或b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是一种重组表达载体，所述的载体是由如上所述的DNA序列与SEQ ID NO. 6所示的编码P -胡萝卜素酮化酶的DNA序列以及质粒或病毒所构建的重组表达载体。所述的质粒是PCAMBIA1301。所述的载体是通过 下列步骤构建的a)把如上所述的DNA序列和SEQ ID NO. 6所示的DNA序列分别连入载体 pMD-18T，得到载体 pMD-18T-bkt 和 pMD-18T_crtR-B ；b)以 pMD_18T_bkt 为模板，以 SEQID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示的DNA序列为引物扩增得到含有BamHI和SacI酶切位点的bkt基因片段，用BamHI和SacI双酶切后与BamHI、SacI双酶切pBI221回收的大片段连接，得到中间载体pBI221-bkt ；c)中间载体pBI221-bkt经HindIII和EcoRI双酶切后的小片段与表达载体PCAMBIA1301经HindIII和EcoRI双酶切的大片段连接，获得中间载体pCAMBIA1301-bkt ；d)以 pMD-18T_crtR-B 为模板，以 SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10 所示的DNA序列为引物扩增得到含有BglII和BstEII酶切位点的约879bp的crtR-B基因片段，用BglII和BstEII双酶切回收后与BglII和BstEII双酶切pCAMBIA1301_bkt回收的大片段连接，获得载体 pCAMBIA1301-bkt-crtR-B。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是一种基因工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞是用如上任一所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。所述的宿主细胞是农杆菌细胞。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是，所述的方法包括以下步骤a)构建如上所述的重组表达载体；b)利用步骤a)所述的重组表达载体转化感受态农杆菌，获得工程菌；c)利用步骤b)获得的工程菌转化苹果组培苗。所述的苹果组培苗是“Brookfield嘎啦”组培苗。本专利技术通过遗传转化，将虾青素合成关键酶基因BKT和CRTR-B转入苹果基因组中，通过调控代谢途径，在苹果中合成虾青素，培育出富含虾青素的苹果，增强苹果叶片和果实的抗光氧化能力，从而提高光合效率、预防日烧的发生，从根本上克服了现有技术的缺点。附图说明附图I是载体pMD-18T图谱。附图2是载体pBI221图谱。附图3是载体pCAMBIA1301图谱。附图4 是载体 pl301-bkt-crtR-B 的 T-DNA 结构图。附图5是转基因与非转基因组培苗的光合放氧速率，新复极差法(SSR)分析，不同字母表不差异水平P < 0. 05。附图6是转基因与非转基因组培苗的Opsii，新复极差法(SSR)分析，不同字母表示差异水平P < 0. 05。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。以下实施例所用材料有培养基(1) YEB培养基，配方为牛肉浸膏5g/L，酵母膏lg/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO4 7H200. 4g/100ml,pH7. 4，固体培养基加入琼脂 I. 5g/100ml。(2) LB 培养基配方为酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaC110g，pH7. 2，固体培养基加入琼脂I. 5g/100ml。(3)培养基M1、M2、M3、M4、M5、M6配方如下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码β？胡萝卜素羟化酶的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列包括：a)SEQ？ID？NO.6所述的核苷酸序列，或b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种编码￠-胡萝卜素羟化酶的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列包括a)SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列，或 b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。2.一种重组表达载体，其特征在于，所述的载体是由权利要求I所述的DNA序列与SEQID NO. 6所示的编码￠-胡萝卜素酮化酶的DNA序列以及质粒或病毒所构建的重组表达载体。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述的质粒是pCAMBIA1301。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在干，所述的载体是通过下列步骤构建的 a)把权利要求I所述的DNA序列和SEQID NO. 6所示的DNA序列分别连入载体PMD-18T，得到载体 pMD-18T-bkt 和 pMD-18T_crtR-B ； b)以pMD-18T-bkt为模板，以SEQID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示的DNA序列为引物扩增得到含有BamH I和Sac I酶切位点的bkt基因片段，用BamHI和SacI双酶切后与BamHI、SacI双酶切pBI221回收的大片段连接，得到中间载体pBI221-bkt ； c)中间载体pBI221-bkt经HindIII和EcoRI双酶切后的小片段与表达载体PCAMBIA1301经HindIII和EcoRI...
【专利技术属性】
技术研发人员：原永兵，贾东杰，秦松，李富超，刘成连，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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