蛋白A的亲和分离材料及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种蛋白A的亲和分离材料和亲和纯化方法，包括下列步骤：(1)用活化基础分离材料固定能够结合蛋白A的配体分子，合成仿生亲和分离材料。(2)用制备的仿生亲和分离材料从含蛋白A的原料中纯化蛋白A。本发明专利技术能够高效率、低成本的大规模生产高纯度的蛋白A。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物
的纯化方法。特别是一种纯化蛋白A的亲和分离材料和蛋白A的亲和纯化方法。
技术介绍
蛋白A是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质，具有与人和多种动物抗体Fe段结合的能力，结合的抗体在高盐或低PH等条件下可以解离，因此，蛋白A被广泛用于抗体分离纯化。在抗体药物的规模化制造中固定化蛋白A是纯化工艺的核心分离材料，每年存在巨大的需求。可用荧光素、酶、生物素、胶体金、放射性核素、铁蛋白等进行标记，代替抗体IgG作为广谱第二抗，作为多种检测技术的指示系统。目前蛋白A在医学、微生物学、免疫学、细胞学及生物学等领域中已得到了广泛应用。由于金黄色葡萄球菌中天然蛋白A表达量低，且不易大规模培养。目前蛋白A主要通过转基因大肠杆菌来大量表达。经对现有技术文献的检索发现，美国专利US5075423报道了一种利固定化IgG亲和层析纯化蛋白A，但该方法一步纯化得到的蛋白A纯度并不高，且纯化的蛋白A产品中存在微量IgG污染，需结合其它方法如离子交换层析精制；此外，固定化IgG本身需要高度纯化，成本昂贵，不利于大规模工业化生产。欧洲专利EP0289129A2依次采用阳离子交换层析，阴离子交换层析纯化蛋白A和乙醇沉淀；美国专利US6555661依次采用疏水作用层析和离子交换层析来纯化蛋白A。这些方法操作步骤复杂，产品回收率低，难于降低生产成本。因此，有必要开发效率高、成本低、生产步骤更简便的蛋白A分离材料和和生产工艺。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有蛋白A生产技术的缺点，提供一种蛋白A的亲和分离材料和纯化蛋白A的亲和方法，使其能够快速、简便、低成本、大批量生产制造蛋白A。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术的纯化方法，即仿生亲和纯化技术，以专一性地识别蛋白A作为基础，其步骤如下(I)合成制备仿生亲和分离材料；用活化基础分离材料固定能够结合蛋白A的配体分子，合成仿生亲和分离材料。(2)用制备的仿生亲和分离材料纯化蛋白A。用上述合成的亲和层析介质制备成亲和层析柱，将含蛋白A的样品流经该亲和层析柱，蛋白A吸附在亲和层析柱上，未结合的其它蛋白被洗去，改变缓冲液条件将结合的蛋白A洗脱下来，得到蛋白A粗品。在步骤(I)中，基础分离材料是一种颗粒状或非微颗粒状，可溶性的或不溶性的，多孔状或无孔的化合物或材料。在一些实施例中，支持介质包括基础层析介质是葡聚糖凝胶珠、交联的葡聚糖珠、、烯丙基葡聚糖和N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶、羟乙基甲基丙烯酸酯，聚丙烯酰胺，二乙烯基苯交联的聚苯乙烯、hyper D,toyopearl填料，以及玻璃、娃、金属氧化物、全氟化碳、膨胀床介质、磁化介质珠、磁性胶体、滤器、滤纸、滤布，或者是毛细管管壁，及其数种的组合，并可有机聚合物涂层。在一些实施例中，活化基础分离材料是用包括溴化氰、羰基二咪唑、二乙烯基砜、吖内酯、三氯三氮嗪、2-氟-I-甲基吡啶(盐)对甲苯磺酸酯、对甲苯磺酰氯、三氟乙基磺酰氯、碘乙酸、溴乙酸、马来酰亚胺、吡啶基二硫化物、环氧基、双环氧烷或者5-硫代-2-硝基苯甲酸作为活化试剂活化的基础分离材料。在步骤(I)中，在另一个实施例中，活化基础分离材料是用包括光活性反应化学利用对重氮苯基乙二醛、重氮苯甲酰肼、磺基琥珀酰-6-(4'-重氮-2'-硝基苯胺)己酸、 或N- -3' - (2' - 二硫代吡啶)丙酰胺进行基础分离材料活化。在步骤(I)中，能够结合蛋白A的配体分子包括正丁胺、正戊胺、环戊胺，正己胺、环己胺，二正己胺、正辛胺、正十一胺，十二胺，金钢胺，2，4_ 二氨基-6-羟基吡唆，2-氨基-2-噻唑啉，2，5-二甲基苯胺；在步骤⑵中，亲和介质吸附蛋白A的条件为pH 6. 5-7. 5，离子强度为0. 0-0. 15MNaCl的缓冲液；洗脱条件为pH3. 0-4. 0，离子强度为0. 0-0. 15MNaCl的缓冲液。所述的蛋白A为天然蛋白A、重组蛋白A和蛋白A突变体。本专利技术克服了蛋白A生产技术中的缺点，使蛋白A生产时分离纯化步骤少，生产成本低，生产效率高，利用蛋白A专一的亲和分离材料，可快速、简便、低成本、大批量纯化蛋白A。具体实施例方式下面结合具体实例做进一步的阐述实施例I :(I)分离材料制备量取正己胺(IOOml)用去离子水(300ml)溶解，与三氯三氮嗪活化的Sepharose琼脂糖珠(300ml)混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6. 5 8. 0之间，置于50°C下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的IM NaCl, 10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到正己胺-5-氯_2，4，6-三氮嗪-S^harose (260ml)，用30 %乙醇储存待用。(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化含蛋白A基因的大肠杆菌培养，诱导，表达后，收集菌体，以Ig菌体/IOml的比例加入磷酸盐缓冲液(IOmM磷酸钠，pH 6. 5,电导率4. 85ms/cm),破碎细胞后，12000rpm离心lOmin，得含蛋白A上清样品。以IN HCl调节pH至6. 5，以饱和NaCl溶液将其电导率调至4. 85ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(IOmM磷酸钠，pH 6. 0,电导率4. 85ms/cm)平衡好的装有按实例I步骤(I)制备的正己胺-5-氯-2,4,6-三氮嗪-Sepharose亲和分离材料的层析柱(lX5cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(IOmM磷酸钠，pH 6.5，电导率4. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸-盐酸缓冲液(0. IM Gly, pH 3. 0)洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为85. I %。实施例2 (I)分离材料制备量取二正己胺(50ml)用去离子水_ (300ml)溶解,与环氧基-Sepharose琼脂糖珠(250ml)混匀，用IM NaHO调节pH在12之间，置于50°C下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的IM醋酸，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到二正己胺-5-氯-2，4，6-三氮嗪-S印harose (200ml)，用30 %乙醇储存待用。(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化取实例I步骤⑵制备的含蛋白A上清样品，以IN HCl调节pH至7. 0，以饱和NaCl 溶液将其电导率调至4. 85mS/cm，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(IOmM磷酸钠，pH7.0,电导率4. 85ms/cm)平衡好的装有制备的二正己胺_5_氯-2,4,6-三氮嗪-Sepharose亲和分离材料的层析柱(lX5cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(IOmM磷酸钠，pH 7. 0，电导率4. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸-盐酸缓冲液(0. IM Gly, pH 3. 0)洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为90. 2 %。实施例3 (I)分离材料制备量取环戊胺(20ml)用去离子水_(300ml)溶解，与环氧基-Sepharose琼脂糖珠(250ml)混匀，用IM NaHO调节pH在12之间，置于50°C下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的IM醋酸，1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白A的亲和分离材料，其特征在于，所述分离材料是用活化基础分离材料固定能够结合蛋白A的配体分子，合成仿生亲和分离材料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣秀，冯争名，杨予宛，
申请(专利权)人：常州荣君生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：