体外筛选试验制造技术

本发明专利技术公开利用体外试验鉴定LOXL2催化活性抑制剂的方法。在某些实施方式中，这些体外试验所鉴定的抑制剂能有效抑制肿瘤结缔织生成和纤维化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于筛选试验领域，用于鉴定治疗结缔组织在其中起作用的各种疾病，包括癌症和纤维化的分子。_7]
技术介绍
已有一些体外试验用于研究肿瘤发生和转移的诸多方面。也有一些体外模型系统用于研究化学诱导的纤维化。已证明胞外基质酶-赖氨酰氧化酶样蛋白_2(L0XL2)在这二种疾病过程中起着作用。参见，例如W02004/047720 (2004年6月10日)；US 2006/0127402(2006 年 6 月 15 日)；US 2009/0053224(2009 年 2 月 26 日)；US2009/0104201 (2009 年4 月 23 日);Kirschmann 等(2002) Cancer Research 62:4478-4483。因此，该赖氨酰氧化酶样-2酶代表了重要的治疗靶标。因此需要筛选L0XL2抑制剂的方法。专利技术简沭本文公开了用于各种体外试验以鉴定能有效阻断L0XL2促结缔织增生和纤维化活性的抑制剂的方法和组合物。因而，本专利技术提供以下及其他内容I. 一种鉴定L0XL2活性抑制剂的方法，所述方法包括a)提供在间质细胞存在下生长的内皮细胞共培养物；b)向该共培养物加入测试分子；和c)检测该共培养物的血管生成或血管发生；其中，与缺乏测试分子的共培养物相比，能减轻该共培养物中血管生成或血管发生程度的测试分子鉴定为L0XL2活性的抑制剂。2.如实施方式I所述的方法，其中所述内皮细胞是人内皮细胞。3.如实施方式2所述的方法，其中所述内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。4.如实施方式I所述的方法，其中所述间质细胞是人细胞。5.如实施方式I所述的方法，其中所述间质细胞是成纤维细胞。 6.如实施方式I所述的方法，其中所述测试分子是多肽。7.如实施方式6所述的方法，其中所述多肽是抗体。8.如实施方式7所述的方法，其中所述抗体是抗-L0XL2抗体。9.如实施方式I所述的方法，其中所述测试分子是核酸。10.如实施方式9所述的方法，其中所述核酸是siRNA。11.如实施方式I所述的方法，其中所述测试分子是分子量低于1，000D的有机小分子。12.如实施方式I所述的方法，其中所述血管生成或血管发生程度降低由血管数目或密度减少证明。13.如实施方式I所述的方法，其中所述血管生成或血管发生程度降低由血管长度减少证明。14.如实施方式I所述的方法，其中所述血管生成 或血管发生程度降低由血管分支程度降低证明。15.如实施方式I所述的方法，其中所述血管生成或血管发生程度降低由⑶31水平降低证明。附图简要说明图I是经50 u g/ml AB0023处理HUVEC的CD31表达染色代表图。图2是经20 ii M苏拉明处理HUVEC的⑶31表达染色代表图。图3是未处理HUVEC的⑶31表达染色代表图。图4是经2ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)处理HUVEC的⑶31表达染色代表图。专利技术详沭除非另有说明，本专利技术的实施采用本领域技能内的细胞生物学、毒理学、分子生物学、生物化学、细胞培养、免疫学、肿瘤学、重组DNA领域和相关领域的标准方法和常规技术。文献中有这类技术的描述可供本领域技术人员获得。例如，可参见Alberts，B等，“Molecular Biology of the cell (《细胞分子生物学》)”,第5版,加兰德科学出版社(Garland Science),纽约，2008 ;Voet, D 等，“Fundamentals of Biochemistry Life atthe molecular level (《生物化学原理分子水平生命》)”,第3版,新泽西州霍博肯的约翰威利父子出版社(John ffiley&Sons), 2008 ;Sambrook, J等,“分子克隆实验室手册”,第3版，冷泉港实验室出版社2001 ;AUSUbel，F等，“分子生物学现代方案”，纽约州的约翰威利父子出版社，1987 及其定期更新；Freshney, R. I. , “Culture of Animal Cells A manualof Basic Technique (《动物细胞的培养基础技术手册》)”，第4版，新泽西州萨默塞特的约翰威利父子出版社，2000和“Methods in Enzymology (《酶学方法》)”丛书,学术出版社(Academic Press),加利福尼亚州圣地亚哥。血管生成试验在某些实施方式中，L0XL2抑制剂的筛选依赖于其抑制L0XL2促血管生成的能力。参见，例如WO 02/11667。因此，在某些实施方式中，通过在体外血管生成试验中抑制血管生成的能力来鉴定某测试物质是否为L0XL2抑制剂。已有多种此类试验(参见，例如Ribatti和 Vacca (1999) Intl. J. Biol. Markers 14 :207-213)。现描述示例性试验。鸡尿囊绒膜鸡胚胎外尿囊绒膜可通过绒毛膜与尿囊膜的融合形成。它与蛋壳直接接触并含有厚的毛细血管网络。该试验可在卵中进行，该情形中在蛋壳上切一窗口以允许观察此膜。或者，取出鸡胚及其连带的膜至培养容器中而得以进行体外试验。参见，例如Auerbach等(1974)Devel. Biol. 41 :391_394，其全文通过引用纳入本文。这两种情形中，都将测试物质施用于该膜并观察和/检测其对血管生成的影响。在某些实施方式中，将测试物质在生物学惰性聚合物中给予该膜，所述聚合物能让测试物质受控地和/或持续地释放。这种聚合物的例子包括但不限于乙烯醋酸乙烯酯共聚物(如Elvax 40)和聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯聚合物(如hydron)。也可采用浸溃了测试物质的胶原凝胶或明胶海棉。参见，例如Nguyen 等，(1994)Microvascular Res. 47 :31-40 ；Ribatti 等，(1997) J. Vascular Res. 34 455-463 ;其全文通过引用纳入本文。已描述了对这种试验的修饰和改进。参见例如Parsons-Wingerter 等(2000)Arteriosclerosis Thrombosis Vase. Biol. 20 :1250-1256 ；Gonzalez-Iriate 等(2003) Angiogenesis 6 :251-254 ;Miller 等,(2004) J. TranslationalMed. 2 4 ;其全文通过引用纳入本文。对于描述该鸡尿囊绒膜试验的目的，也可参见Ribatti等(1996) Intl. J. Devel.Biol.40 1189-1197 ；Ribatti 等(2000)Curr.Pharmacol.Biotechnol. I :72-73 ；Richardson 和 Singh(2003)Curr. Drug Targets Cardiovasc. Hematol. Disorders 3: 155-185 和 Ribatti (2004) Leukemia 18 :1350_1351，其全文通过引用纳入本文。角膜袋试验在此试验中，将含有测试物质的缓释团粒植入在无血管家兔眼睛角膜基质中。测得的任何血管形成都是由于新形成的血管。参见，例如Hartwell (本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.08.21 US 61/235,7961.一种鉴定L0XL2活性抑制剂的方法，所述方法包括 (a)提供内皮细胞在基质细胞存在下生长的共培养物； (b)向该共培养物加入测试分子；和 (C)检测该共培养物的血管生成或血管发生； 其中，使共培养物中的血管生成或血管发生程度比缺乏测试分子的共培养物降低的测试分子鉴定为L0XL2活性抑制剂。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人内皮细胞。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)。4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述基质细胞是人细胞。5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述基质细胞是成纤维细胞。6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述测试分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·马歇尔，V·史密斯，
申请(专利权)人：吉联亚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：