一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，属于食品微生物技术控制领域。本发明专利技术的鉴定方法是先检测待鉴定物质的最小抑菌浓度，然后用加入了待鉴定物质的培养基培养食源菌，采用哈氏弧菌BB170为发光菌株，检测混合菌中群体感应信号分子AI-2的活力，AI-2活力值低于不添加该物质对照组的值，即为食源菌生物被膜形成抑制剂。本发明专利技术的鉴定方法避免了菌体耐药性的产生，且鉴定时间短，可以在5小时内鉴定出某物质是否为生物被膜抑制剂，对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均适用。简单、方便的鉴定技术能应用在食品、药品加工环境微生物污染控制，食品加工中天然防腐剂的开发使用等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食品微生物控制
，具体涉及。
技术介绍
食品安全已成为全球重要的公共卫生问题，食源性病原菌是引起食源性疾病的首要原因，它对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。据有关专家估计，其中约65%人类细菌性感染是由生物被膜引起的，因此在食品工业中形成的生物被膜才是引起食源性疾病的罪魁祸首。生物被膜是指细菌附着于生物的或非生物的接表面生长，分泌多糖、蛋白质等多聚物构成胞外基质，将自身包裹其中而形成的大量细菌聚集物。细菌的这种生活方式可以帮助其抵抗环境中的各种不利因素，如大量氧基、抗生素的合成、过酸或过碱的环境、被宿·主免疫细胞吞噬等，生物膜细菌对抗生素的抵抗力是浮游细菌的数百倍甚至上千倍。在食品加工环境中，微生物易在富有养分的各种固体表面附着，形成生物被膜。使得加工设备表面受损，热传递效率降低增加，甚至引起金属表面的腐蚀，带来影响食品安全和卫生的隐串■/Qi、O近年来的研究发现群体感应系统与细菌生物膜的形成亦存在着密切联系。群体感应(quorum sensing，QS)是指细菌自体分泌一类特殊的化学物质-自体诱导物(autoinducers,AIs)并转运至细胞外,这类化学物质在胞外逐渐累计直至其浓度到达某种域值时，再转至胞内与特定物质结合或直接被细胞内特定物质所感知，进而调控胞内特定基因的表达，完成细菌间的信号交流。通过群体感应系统，细菌能够协调完成一系列生命活动，如生物发光，抗生素合成，固氮基因调控，生物膜的形成等。Al - 2被认为是细菌通用的信号分子，参与细菌间的交流，调控细菌的群体行为。生物被膜的控制是食品加工中的一大难题，由于生物膜的普遍存在性和难以清除性，使得食品的交叉污染相当严重。过去清除生物被膜的一般做法是加大杀菌剂量和提高杀菌温度，但过高的温度会破坏食品营养，还可能会产生有害物质,加大杀菌剂量易产生药物残留,危害人体健康,而天然产物由于来源植物或动物体内对人体健康安全，所以从群体感应角度在天然产物中筛选对信号分子合成的抑制剂对控制细菌成膜具有重大意义，将会给食品加工贮藏业带来广阔的前景。近些年来已经有很多文献都描述了天然QSI化合物的存在，Hentzer M, Wu H等发现红藻产的溴化呋喃在很多细菌中都能够抑制QS，大幅降低生物膜对抗生素的敏感性。李斌、董明等人研究了黑木耳提取物对细菌群体感应及生物膜形成的抑制。目前，直接检测抑制生物膜形成的方法主要有显微镜形态学观察和胞外基质染色法。扫描电镜可观察生物膜表面结构，是检测的金标准，但其价格昂贵直接限制了应用。胞外基质的染色法有阿利新兰-刚果红联合染色法、银染法、半定量结晶紫染色法等。但是该方法操作步骤多，且在固定、染色、清洗等各环节中，均可能导致生物膜的脱落与破坏。如果建立群体感应信号分子与生物被膜形成的关系，可以通过检测抑制对群体感应信号分子活性进而鉴定生物被膜抑制剂则更加快速简易。储卫华，刘永旺等人用紫色杆菌报告菌检测细菌型信号分子AHLs及其抑制物，该方法虽然快速，但是AHLs只存在于革兰氏阴性菌中，无法检测革兰氏阳性菌的信号分子。 到目前为止，仍未见到对食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的 研究发现群体感应信号分子AI-2与生物被膜形成能力存在相关性，在此基础上，进一步选用哈氏弧菌BB170作报告菌株，通过其发光强弱快速检测到群体感应信号分子AI-2的活性，即可判断该抑制剂对食源菌生物被膜形成的抑制效应。本专利技术提供以下鉴定食源菌生物被膜形成抑制剂方法的技术方案。，步骤如下 (1)接种食源菌，加入梯度浓度的待鉴定物质培养，检测待鉴定物质的最小抑菌浓度MIC ； (2)食源菌培养基中加入1/2MIC的待鉴定物质，以未加待鉴定物质的培养基作为阳性对照，培养食源菌至对数期； (3)将培养至OD值达到O.9的哈氏弧菌BB170进行稀释，清除自身存在的生物发光干扰，将步骤(2)所得培养物分别离心，取上清液经过滤后加入到哈氏弧菌BB170的稀释液中，检测哈氏弧菌BB170的发光强度，获得群体感应信号分子AI-2的活力值，如果AI-2的活力值低于不添加该物质对照组的值，则待鉴定物质为生物被膜形成抑制剂。其中，食源菌包括肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。作为一种优选方案，上述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法还包括步骤(4 )，采用微孔板染色法测定食源菌粘附值进行验证。作为一种优选方案，上述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法中，步骤(I)中食源菌的接种量为IO6CFU,加入待鉴定物质的浓度采用二倍稀释法。食源菌培养时间为16小时. 作为一种优选方案，上述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，步骤(3)中离心条件为13000rpm离心lOmin，过滤用滤膜孔径为O. 22Mm。所述哈氏弧菌BB170的稀释液配制为将新鲜的AB培养基以1:5000稀释哈氏弧菌88170的培养物。AB培养基配方为0. 3MNaCl , O. 05M MgSO4, O. 2% (W/V)酸水解酪蛋白，用KOH调节PH至7. 5，121°C高压灭菌20min。冷却后每IOOml培养基中加入ImL IM 磷酸钾缓冲液，ImL O. IM精氨酸，2mL 50%甘油。作为一种优选方案，上述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，步骤(4)微孔板染色法测定食源菌粘附值具体步骤为将培养的食源菌取菌悬液加入添加了 1/2MIC待鉴定物质的微孔板中，以未接种食源菌的培养基为阴性对照，未添加待鉴定物质的培养基为阳性对照；培养结束后用酶标仪测定各组在波长630nm处的光密度值為；倒掉孔板中的培养基，用蒸馏水洗去浮游菌；微孔板在室温下干燥2h后，加入质量浓度为1%结晶紫100 μ L/孔,放置20min,随后用蒸懼水洗至水洗液为无色,孔板在室温下再干燥30min,加入体积浓度为95%的乙醇100 u L/孔，震荡后用酶标仪测定630nm处的光密度值义，采用以下公式计算粘附值B :本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，其特征在于步骤如下 (1)接种食源菌，加入梯度浓度的待鉴定物质培养，检测待鉴定物质的最小抑菌浓度MIC ； (2)食源菌培养基中加入1/2MIC的待鉴定物质，以未加待鉴定物质的培养基作为阳性对照，培养食源菌至对数期； (3)将培养至OD值达到0.9的哈氏弧菌BB170进行稀释，清除自身存在的生物发光干扰，将步骤(2)所得培养物分别离心，取上清液经过滤后加入到哈氏弧菌BB170的稀释液中，检测哈氏弧菌BB170的发光强度，获得群体感应信号分子AI-2的活力值，如果AI-2的活力值低于不添加该物质对照组的值，则待鉴定物质为生物被膜形成抑制剂。2.根据权利要求I所述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，其特征在于还包括步骤(4 )，采用微孔板染色法测定食源菌粘附值进行验证。3.根据权利要求I或2所述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，其特征在于步骤(I)中食源菌的接种量为IO...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文艳，张宏梅，陶志华，周文渊，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：