用于检测致癌融合蛋白的邻近介导试验制造技术

本发明专利技术提供用于检测生物样品如全血或肿瘤组织中一种或多种致癌融合蛋白的活化状态和/或总量的基于抗体的阵列及其使用方法。在某些情况下，样品中存在的所述致癌融合蛋白的活化状态和/或总量可与一种或多种信号转导分子联合测量。本发明专利技术的组合物和方法具有酶联免疫吸附实验相关的特异性、信号放大相关的灵敏度、和微阵列相关的高通量多重性的优势。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测致癌融合蛋白的邻近介导试验相关申请的交叉参考本申请要求2009年10月20日提交的美国临时申请号61/253，393、2010年2月16日提交的美国临时申请号61/305，084、2010年4月23日提交的美国临时申请号61/327，487和2010年9月15日提交的美国临时申请号61/383，037的优先权，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
技术介绍
融合蛋白还称为嵌合蛋白，是通过连接两个或多个原始编码分离蛋白的基因产生的蛋白。该融合基因的翻译产生具有衍生自各原始蛋白的功能性质的单一多肽。当大规模突变(通常是染色体移位)产生含两个不同基因的部分编码序列的新编码序列时，出现嵌合突变蛋白。天然产生的融合蛋白在癌症中很重要，其中所述蛋白起癌蛋白的作用。 BCR-ABL融合蛋白是致癌融合蛋白的熟知示例。其被认为是慢性髓细胞性白血病(CML)的主要致癌驱动物，但其还与急性淋巴细胞白血病相关。事实上，CML的细胞遗传学特征是费城染色体(Ph)，其形成编码210kDa蛋白的BCR-ABL融合基因。确实，产生的BCR-ABL融合蛋白是对CML发病机理关键的活性酪氨酸激酶。尽管伊马替尼(GleeveP)目前是新诊断的CML患者的一线疗法，但约20-25%的患者没有实现持久的完全细胞遗传学反应。研究显示存在连续伊马替尼治疗时BCR-ABL信号传导的再激活是产生抗性的主要原因。在大多数患者中，再激活是BCR-ABL激酶结构域中突变的结果，所述突变损害伊马替尼结合并诱导药物抗性。因此，发现BCR-ABL活性的检测可用于预测对用酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼的治疗响应以及鉴定对所述抑制剂产生抗性的患者。当前，可用的检测BCR-ABL活性的方法依赖于对BCR-ABL底物-磷酸化CRKL (pCRKL)的测量。例如 La Rosee^ (Haematologica, 93:765-9 (2008))描述了 Western印迹分析总白细胞裂解物以检测替代BCR-ABL活性的pCRKL水平(也参见，Hochhaus等，Leukemia, 16:2190-6(2002) ;White 等，J. Clin. Oncol.，25:4445-51 (2007))。相似地，Khorashad等(Haematologica, 94:861-4(2009))描述了基于流式细胞分析的方法测量pCRKL 水平以评估 BCR-ABL 活性(也参见，Hamilton 等，Leukemia, 20:1035-9 (2006))。然而，这些方法缺少测定样品中BCR-ABL活性存在或水平所需的特异性和灵敏度，因为它们是依赖于检测替代蛋白磷酸化的单一抗体试验。因此，需要检测BCR-ABL活性以及其他致癌融合蛋白活性的特异性和灵敏方法用于诊断、预后和治疗目的。本专利技术满足这种需要，并提供相关优点。专利技术概述本专利技术提供用于检测生物样品如全血(如从分离的稀有循环细胞或白细胞制备的裂解物)或肿瘤组织(如细针吸出物)中一种或多种致癌融合蛋白的活性状态和/或总量的基于抗体的阵列及其使用方法。在某些情况下，样品中存在的所述致癌融合蛋白的活性状态和/或总量可与一种或多种信号转导分子联合测量。本专利技术的组合物和方法具有酶联免疫吸附实验相关的特异性、信号放大相关的敏感性、和微阵列相关的高通量多重性的优势。在一个方面，本专利技术提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括(a)将细胞提取物与特异于第一全长蛋白的第一结构域的第一结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的第一全长蛋白转化为含所述第一全长蛋白和所述第一结合部分的复合物的条件下接触，其中所述第一全长蛋白的第一结构域在对应的致癌融合蛋白中不存在，所述融合蛋白包含与第二不同全长蛋白的第一结构域融合的第一全长蛋白的第二不同结构域。(b)将步骤(a)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第一全长蛋白的细胞提取物；(C)将步骤(b)中的细胞提取物与特异于所述第一全长蛋白的第二不同结构域的第二结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的致癌融合蛋白转化为含所述致癌融合蛋 白和所述第二结合部分的复合物的条件下接触；和(d)测定步骤(C)中复合物的水平或活化状态，从而测定所述致癌融合蛋白的水平或活化状态。在具体实施方式中，测定致癌融合蛋白的水平或激活状态包括检测致癌融合蛋白(如细胞提取物中)的表达(如浓度)水平和/或活化(如磷酸化)。在优选实施方式中，本专利技术的步骤(C)和(d)包括本文所述的酶联免疫吸附实验(ELISA)、流式细胞分析、标签分选试验或邻近双检测(proximity dual detection)试验。在邻近双检测试验的一个具体实施方式中，本专利技术提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括(a)用致癌融合蛋白特异性捕获抗体的稀释系列孵育细胞提取物形成多种捕获的致癌融合蛋白，其中所述捕获抗体被限制在固体支持物上，其中所述致癌融合蛋白包含对应第一蛋白的第一结构域和对应第二不同蛋白的第二结构域，且其中所述捕获抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域。(b)用特异于所述致癌融合蛋白的第二结构域的至少两种类型检测抗体孵育所述多种捕获的致癌融合蛋白，形成多种捕获的可检测致癌融合蛋白，其中所述检测抗体包括(I)标记有协助部分的多种活化状态非依赖性抗体，和(2)标记有信号放大对的第一元件的多种活化状态非依赖性抗体，其中所述协助部分生成传送至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂；(C)用信号放大对的第二元件孵育多种捕获的可检测致癌融合蛋白，生成放大的信号；和(d)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。在邻近双检测试验的另一个具体实施方式中，本专利技术提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括(a)用致癌融合蛋白特异性捕获蛋白的稀释系列孵育细胞提取物形成多种捕获的致癌融合蛋白，其中所述捕获抗体被限制在固体支持物上，其中所述致癌融合蛋白包含对应第一蛋白的第一结构域和对应第二不同蛋白的第二结构域，且其中所述捕获抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域。(b)用至少两种类型的检测抗体孵育所述多种捕获的致癌融合蛋白，形成多种捕获的可检测致癌融合蛋白，其中所述检测抗体包括(1)标记有协助部分的多种活化状态非依赖性抗体，其中所述活化状态非依赖性 抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域，和(2)标记有信号放大对的第一元件的多种活化状态依赖性抗体，其中所述活化状 态依赖性抗体特异于所述融合蛋白的第二结构域，其中所述协助部分生成传送至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂。(c)用信号放大对的第二元件孵育多种捕获的可检测致癌融合蛋白，生成放大的 信号；和(d)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。在另一方面，本专利技术提供给患癌并接受癌症治疗疗程的对象最佳化治疗和/或降 低毒性的方法，所述方法包括(a)给予抗癌药后分离癌细胞；(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物；(c)用本文所述试验测量所述细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或活化水 平；和(d)将所测致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白 的表达和/或活化水平作比较；和(e)基于步骤(d)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的 疗程。在某些实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·辛格，X·刘，
申请(专利权)人：普罗米修斯实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：