检测稀有循环细胞内多种信号转导分子的基于抗体的阵列制造技术

本发明专利技术提供了用于检测稀有循环细胞内众多信号转导分子的活化状态和／或总量的基于抗体的阵列以及使用该阵列来帮助癌症预后和诊断及设计个性化、定向治疗的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测稀有循环细胞内多种信号转导分子的基于抗体的阵列 相关申请的交叉引用0001本申请要求2006/9/21提交的美国专利申请号U/525,598(该申请已变 为美国临时专利申请No. 一)和2007/8/20提交的美国临时申请号60/913,087的 优先权，出于所有目的将它们的内容通过引用全文纳入本文。
技术介绍
经常在癌症不同早期阶段的患者血液内发现"微小转移"肿瘤细胞(散 布肿瘤细胞)，在转移癌中也有发现。血液中肿瘤细胞的数目取决于肿瘤的阶段 和类型。肿瘤是极其异质性的。因此，单个部位的活检样品可能无法代表肿瘤群 的异质性。活检样品通常从原发性肿瘤上获得；然而，无法对大多数转移瘤进行 活检，从而更难于对肿瘤样品进行分子分析。图9显示了在微阵列ELISA中用抗EGFR胞外域的单克隆抗体作为 捕获抗体和抗磷酸化EGFR的单克隆抗体作为检测抗体检测A431细胞中的磷酸 化EGFR。 (a)基于细胞数的捕获抗体稀释曲线。微阵列ELISA具有宽动态范围， 可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检测约I-IO，OOO个细胞内的磷酸化EGFR。 (b) 基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲线，显示可从一个细胞检测磷酸化 EGFR。(c)稀释系列中各种捕获抗体浓度的细胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。 当捕获抗体浓度为0.125毫克/毫升时(箭头)单细胞水平的信噪比为1.33。0019j附图说明图10显示了在微阵列ELISA中用抗ErBb2胞外域单克隆抗体作为捕 获抗体和检测抗体检测SKBr3细胞中的总ErBb2。 (a)基于细胞数的捕获抗体稀 释曲线。微阵列ELISA具有宽动态范围，可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检 测约1-10,000个细胞内的ErBb2。 (b)基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲 线，显示可从一个细胞(箭头)检测ErBb2。 (c)稀释系列中各种捕获抗体浓度的细 胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。当捕获抗体浓度为0.125毫克/毫升时(箭头) 单细胞水平的信噪比为15.27。0020图11显示了在微阵列ELISA中用抗ErBb2胞外域的单克隆抗体作为 捕获抗体和抗磷酸化ErBb2的单克隆抗体作为检测抗体检测SKBr3细胞中的磷 酸化ErBb2。 (a)基于细胞数的捕获抗体稀释曲线。微阵列ELISA具有宽动态范 围，可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检测约1-10,000个细胞内的ErBb2。(b)基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲线，显示可从一个细胞(箭头)检测磷酸化 ErBb2。(c)稀释系列中各种捕获抗体浓度的细胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。 当捕获抗体浓度为0.125毫克/毫升时(箭头)单细胞水平的信噪比为5.45。图13显示了单检测器微阵列ELISA与相近双检测器微阵列ELISA的 检测特异性。(a)单检测器模式下各种捕获抗体浓度时A431细胞中磷酸化EGFR 的滴定曲线。由于该模式下单个检测抗体缺乏特异性因此观察到非常高的背景。(b)相近双检测器模式下各种捕获抗体浓度时A431细胞中磷酸化EGFR的滴定 曲线。由于该模式下通过检测两个检测抗体之间的相近性获得了提高的特异性因 此观察了非常低的背景。图15显示了在受激A431细胞的滴定分析中检测磷酸化She的水平。 可寻址阵列同时提供EGFR和HER2磷酸化信息。图18显示了包含与葡萄糖氧化酶(GO)-寡核苷酸杂交的Alexa 647-寡核苷酸-偶联的抗-EGFR抗体、HRP-偶联的抗-磷酸化EGFR抗体、以及局限在 固相支持体上的EGFR捕获抗体的多重磷酸化EGFR复合体的形成。术语"分析物"包括任何感兴趣的分子，通常是大分子如多肽，其存在、 含量和/或同一性是确定的。某些情况下，分析物是实体瘤循环细胞的细胞组分， 优选信号转导分子。术语"活化状态依赖性抗体"包括对样品中一种或多种感兴趣分析物的 特定活化状态具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合体)的检测抗体。在 优选实施方式中，所述活化状态依赖性抗体检测一种或多种分析物如一种或多种信号转导分子的磷酸化、泛素化和/或复合状态。一些实施方式中，受体酪氨酸激酶EGFR家族成员的磷酸化和/或EGFR家族成员之间异二聚复合体的形成用 活化状态依赖性抗体检测。适合用活化状态依赖性抗体检测的活化状态(在括号 中列出)的非限制性例子包括EGFR(EGFRvIII，磷酸化(p-) EGFR， EGFR: Shc， 泛素化(u-)EGFR， p-EGFRvIII); ErbB2(p85:截短的(Tr)-ErbB2， p-ErbB2， p85: Tr-p-ErbB2， Her2: Shc， ErbB2: PI3K， ErbB2: EGFR， ErbB2: ErbB3， ErbB2: ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3， ErbB3: PI3K， p-ErbB3: PI3K， ErbB3: She); ErbB4 (p-ErbB4， ErbB4: She); IGF-1R(p-IGF-lR， IGF-1R: IRS， IRS: PI3K， p陽IRS， IGF-1R: PI3K); INSR (p-INSR); KIT (p-KIT); FLT3 (p墨FLT3); HGFR1 (p-HGFRl); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRa (p-PDGFRa); PDGFRP (p-PDGFRP); VEGFR1 (p-VEGFRl ， VEGFR1: PLOy， VEGFR1: Src); VEGFR2 (p-VEGFR2 ， VEGFR2: PLCy， VEGFR2: Src， VEGFR2:硫酸肝素，VEGFR2: VE-钙粘蛋 白)；VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFRl); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); Tiel (p陽Tiel); Tie2 (p隱Tie2); EphA (p陽EphA); EphB (p-EphB); NFKB禾口/或1KB (p-IK (S32)， p-NFKB (S536)， p-P65: IKBa); Akt (p-Akt (T308， S473)); PTEN (p-PTEN); Bad (p-Bad (Sl 12， S136)， Bad: 14-3-3); mTor (p-mTor(S2448)); p70S6K (p-p70S6K (T229, T389)); Mek (p-Mek (S217， S221)); Erk (p-Erk (T202， Y204)); Rsk-l (p-Rsk-l (T357， S363)); Jnk (p-Jnk (T183， Y185)); P38 (p-P38 (T180， Y182)); Stat3 (p-Stat-3 (Y705， S727)); Fak (p-Fak (Y576)); Rb(p-Rb(S249， T252, S780)); Ki67; p53 (p-p53 (S392， S20)); CREB (p-CREB (S133)); c-Jun 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种进行具有高动态范围的多重、高通量免疫测定的方法，该方法包括：　（ａ）将细胞提取物与该细胞提取物中一种或多种分析物的特异性捕获抗体的众多稀释系列一起培育以形成众多捕获分析物，其中所述捕获抗体局限在固相支持体上；　（ｂ）将所述众 多捕获的分析物与相应分析物的特异性检测抗体一起培育以形成众多可检测的捕获分析物，其中所述检测抗体包含：　（１）众多用易化部分标记的活化状态非依赖性抗体，和　（２）众多用信号放大对的第一成员标记的活化状态依赖性抗体，　其中所 述易化部分产生导向信号放大对的第一成员并与其反应的氧化剂；　（ｃ）将众多可检测的捕获分析物与信号放大对的第二成员一起培育以产生放大信号；和　（ｄ）检测信号放大对的第一和第二成员产生的放大信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J哈维，S辛格，P金，X刘，R巴罕姆，L刘，
申请(专利权)人：普罗米修斯实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]