一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，包含以下步骤：(1)制备目标稀有细胞悬浮液的标准样本和待测样本；(2)分别加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即分别进行免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测；(3)对标准样本和待检样本进行恒温免疫孵育，每隔相同时间间隔进行核磁共振弛豫时间检测；(4)绘制标准样本的免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线；(5)计算待检样本的弛豫时间改变量，依据步骤(4)中绘制的曲线得到待检样本中稀有细胞的浓度。本发明专利技术可简便、快速、高特异性、高灵敏度地实时直观检测稀有细胞浓度和个数。

【技术实现步骤摘要】
一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法
本专利技术涉及分子生物学检测技术，特别涉及一种生物体液样本中稀有细胞的检测方法。
技术介绍
稀有细胞是指生物体液样本(包括血液、胸水、腹水、尿液、脑脊液等)中的一些非典型细胞，大量研究表明，对稀有细胞的检测和鉴定对于相关疾病的病理机制及靶向药物开发具有重要指导意义。因此，寻找准确、快速地的稀有细胞检测方法将成为亟待解决的问题。然而稀有细胞在生物体液中的浓度非常低，与非目标细胞的比例大约是1：107，用传统技术无法计数，所以迫切需要一种简单准确快速的方法解决这一难题。由于稀有细胞在体液中的含量很少，要经过有效的富集步骤才能在后续的实验中识别鉴定。目前市场上广泛应用于稀有细胞检测研究的方法主要有密度梯度离心法、膜过滤法和免疫磁性分离技术。密度梯度区带离心法又称为区带离心法，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。使用此法可以同时使样品中几个活全部组分分离，具有良好的分辨率。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液。研究中经常利用密度梯度离心的原理，用ficoll液分离和纯化人或动物外周血单个核细胞(PBMC)。膜过滤方法是根据某些稀有细胞体积大于外周血中粒细胞从而使稀有细胞从外周血中分离富集出来，然后利用免疫荧光技术对稀有细胞进行鉴别诊断。该方法中，膜过滤细胞富集过程相对容易，但是并不是所有稀有细胞体积都大于外周血中粒细胞的，很多稀有细胞的体积和粒细胞大小差不多，甚至比粒细胞体积更小。基于以上的认识，膜过滤方法被逐渐抛弃。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可简便、快速、高特异性、高灵敏度地实时直观检测循环稀有细胞的低场核磁共振检测分析方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，包含以下步骤：(1)样本制备将纯培养的目标稀有细胞，利用有限稀释法以缓冲液进行细胞个数的梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心，获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得目标稀有细胞悬浮液待检样本；(2)免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20；取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20’；(3)免疫孵育中核磁共振弛豫时间检测取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T2n，其中，n≥1，且n为整数；取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T2n’，其中，n≥1，且n为整数；(4)标准样本的免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线的制作以标准样本的免疫孵育时间t为横坐标，弛豫时间值T2n为纵坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线；计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T2n-T20，以ΔT2为纵坐标，以免疫孵育时间t为横坐标，对每个细胞梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线。通过此曲线的绘制可获得核磁共振造影剂与检测样本的最佳孵育时间，二者充分孵育；以标准样本的弛豫时间改变量ΔT2最大值为纵坐标，以标准样本中的稀有细胞数个为横坐标，制作孵育细胞数-弛豫时间改变量ΔT2最大值曲线，以检测本方法的灵敏度；(5)待检样本浓度得出绘制最佳孵育时间下各标准样本的细胞数-弛豫时间改变量标准曲线；计算最佳孵育时间下待检样本的弛豫时间改变量ΔT2test，所述ΔT2test＝T2n’-T20’，依据上述绘制的最佳孵育时间下标准样本的孵育细胞数-弛豫时间改变量曲线，从而得出待检样本中目标稀有细胞的浓度/个数。可选地，上述步骤(3)中，在恒温下进行免疫孵育的恒温温度选自4～8℃，每次测定核磁共振弛豫时间的时间间隔为10～15min。由上述检测步骤可知，本专利技术提供了一种简便、快速、高特异性、高灵敏度地实时直观检测循环稀有细胞的低场核磁共振检测分析方法。由于低场NMR的磁体温度一般高于35℃，为了保证测试的特异性和灵敏性，抗原抗体的反应一般低温长时间孵育，我们通过对细胞抗原和免疫磁珠偶联的抗体反应进行实时监控，观察整个反应过程是否完全，进而达到对微量循环稀有细胞精确定量的作用，提高此检测反应的灵敏性。本专利技术中所述的目标稀有细胞的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间特性参数的变化，所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间T。本专利技术的方法具有超高灵敏度，可以精确到一个细胞的检测，且快速、便捷，可以用于大规模样本的快速检测。优选地，本专利技术的检测方法中，所使用的低场核磁共振分析仪内设有温度控制设备，通过所述的温度控制设备，控制免疫孵育的恒温温度，这样可以方便地实现对系统的自动恒温控制。优选地，本专利技术的检测方法中，步骤(2)中所使用的核磁共振造影剂为顺磁性纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠，且所述的顺磁性纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠优选为抗EpCAM免疫纳米磁珠、抗CD45免疫纳米磁珠、链霉亲和素纳米磁珠、叶酸修饰的磁性脂质体中的一种或几种。上述的免疫磁珠将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，从而快速地实现从混合细胞群中捕获和分离稀有目标细胞的目的，所得稀有细胞可用于计数或其他方面研究应用。优选地，本专利技术的检测方法中，所述步骤(2)和步骤(3)中，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度为20～25MHz，磁体温度为30～35℃，重复时间3～5s。更优选地，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度优选为20.18MHz，磁体温度优选为35℃，重复时间优选为5s。对上述核磁共振体系磁场强度、磁体温度和重复时间的控制，可使检测更加准确，可控性更强，且利于平行实验的比较和质控。优选地，本专利技术的检测方法中，所述步骤(4)中，计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2和待检样本的弛豫时间改变量ΔT2test时，分别取两次以上测量弛豫时间的平均值进行计算，从而能使本专利技术的检测结果更为准确可靠。由上面的论述可知，本专利技术通过使用带温度控制系统的低场核磁共振仪，实时检测细胞抗原和磁珠偶联的特异性抗体反应，大大提高稀有细胞的灵敏度，不仅可用来判断整个反应过程是否完全，而且使整个检验过程更加灵敏。在本申请提交的同时，申请人还提交了一份名称为“一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR检测稀有细胞的方法”的专利技术专利申请，该检测方法相对于现有技术的优点是检测时间短、价格低、自动化程度高、灵敏度高，但该方法仍存在不足之处：即无法控制样品温度，对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本制备将纯培养的目标稀有细胞，利用有限稀释法以缓冲液进行细胞个数的梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心，获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得目标稀有细胞悬浮液待检样本；(2)免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20；取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20’；(3)免疫孵育中核磁共振弛豫时间检测取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T2n，其中，n≥1，且n为整数；取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T2n’，其中，n≥1，且n为整数；(4)标准样本的免疫孵育时间‑弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间‑弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数‑弛豫时间改变量最大值曲线的制作以标准样本的孵育时间t为横坐标，弛豫时间值T2n为纵坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间‑弛豫时间T2n标准曲线；计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T2n‑T20，以ΔT2为纵坐标，以免疫孵育时间t为横坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间‑弛豫时间改变量标准曲线，得到核磁共振造影剂与目标稀有细胞的最佳孵育时间；以标准样本的弛豫时间改变量ΔT2最大值为纵坐标，以标准样本中的稀有细胞数个为横坐标，制作孵育细胞数‑弛豫时间改变量ΔT2最大值曲线，以检测本方法的灵敏度；(5)待检样本浓度得出绘制最佳孵育时间下标准样本的细胞数‑弛豫时间改变量标准曲线；计算最佳孵育时间下待检样本的弛豫时间改变量ΔT2test，所述ΔT2test＝T2n’‑T20’，根据ΔT2test结合上述绘制的最佳孵育时间下标准样本的细胞数‑弛豫时间改变量标准曲线，得出待检样本中目标稀有细胞的个数和浓度。...

【技术特征摘要】
2014.07.09 CN 201410326369.11.一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本制备将纯培养的目标稀有细胞，利用有限稀释法以缓冲液进行细胞个数的梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心，获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得目标稀有细胞悬浮液待检样本；(2)免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20；取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20’；(3)免疫孵育中核磁共振弛豫时间检测取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T2n，其中，n≥1，且n为整数；取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T2n’，其中，n≥1，且n为整数；(4)标准样本的免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线的制作以标准样本的孵育时间t为横坐标，弛豫时间值T2n为纵坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间T2n标准曲线；计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T2n-T20，以ΔT2为纵坐标，以免疫孵育时间t为横坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线，得到核磁共振造影剂与目标稀有细胞的最佳孵育时间；以标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：张祥林，
申请(专利权)人：张祥林，
类型：发明
国别省市：上海;31