一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，包含以下步骤：(1)制备目标稀有细胞悬浮液的标准样本和待测样本；(2)分别加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即分别进行免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测；(3)对标准样本和待检样本进行恒温免疫孵育，每隔相同时间间隔进行核磁共振弛豫时间检测；(4)绘制标准样本的免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线；(5)计算待检样本的弛豫时间改变量，依据步骤(4)中绘制的曲线得到待检样本中稀有细胞的浓度。本发明专利技术可简便、快速、高特异性、高灵敏度地实时直观检测稀有细胞浓度和个数。

【技术实现步骤摘要】
一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法
本专利技术涉及分子生物学检测技术，特别涉及一种生物体液样本中稀有细胞的检测方法。
技术介绍
稀有细胞是指生物体液样本(包括血液、胸水、腹水、尿液、脑脊液等)中的一些非典型细胞，大量研究表明，对稀有细胞的检测和鉴定对于相关疾病的病理机制及靶向药物开发具有重要指导意义。因此，寻找准确、快速地的稀有细胞检测方法将成为亟待解决的问题。然而稀有细胞在生物体液中的浓度非常低，与非目标细胞的比例大约是1：107，用传统技术无法计数，所以迫切需要一种简单准确快速的方法解决这一难题。由于稀有细胞在体液中的含量很少，要经过有效的富集步骤才能在后续的实验中识别鉴定。目前市场上广泛应用于稀有细胞检测研究的方法主要有密度梯度离心法、膜过滤法和免疫磁性分离技术。密度梯度区带离心法又称为区带离心法，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。使用此法可以同时使样品中几个活全部组分分离，具有良好的分辨率。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本制备将纯培养的目标稀有细胞，利用有限稀释法以缓冲液进行细胞个数的梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心，获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得目标稀有细胞悬浮液待检样本；(2)免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20；取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时...

【技术特征摘要】
2014.07.09 CN 201410326369.11.一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本制备将纯培养的目标稀有细胞，利用有限稀释法以缓冲液进行细胞个数的梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心，获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得目标稀有细胞悬浮液待检样本；(2)免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20；取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20’；(3)免疫孵育中核磁共振弛豫时间检测取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T2n，其中，n≥1，且n为整数；取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T2n’，其中，n≥1，且n为整数；(4)标准样本的免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线的制作以标准样本的孵育时间t为横坐标，弛豫时间值T2n为纵坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间T2n标准曲线；计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T2n-T20，以ΔT2为纵坐标，以免疫孵育时间t为横坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线，得到核磁共振造影剂与目标稀有细胞的最佳孵育时间；以标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：张祥林，
申请(专利权)人：张祥林，
类型：发明
国别省市：上海;31