检测过氧化氢的生物电化学传感器及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种检测过氧化氢的生物电化学传感器及其制备方法。该新型生物电化学传感器为三电极体系传感器，其中对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极。本发明专利技术基于一种序列特异的多肽对辣根过氧化物酶的定向结合及其对该酶活性的促进作用，以及电化学检测方法高灵敏度的特点，有效地提高了过氧化氢传感器的灵敏度，取得了满意的结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种新型生物电化学传感器及其制备方法，特别是ー种检测过氧化氢的新型生物电化学传感器及其制备方法。
技术介绍
过氧化氢(H2O2)在食品、制药、エ业、生物、临床应用和环境工程等许多领域都发挥着重要的作用，如食品加工、造纸业、消毒等。然而，过氧化氢作为ー种大气污染物，是酸雨形成因素之一。此外，过氧化氢是细胞衰老、死亡以及ー些病理状态细胞代谢的副产物。因此，快速、灵敏地检测过氧化氢是科学界长期以来关注的ー个问题。目前，检测过氧化氢的方法主要有滴定法、分光光度法、化学发光法、荧光测定法以及电化学方法，其中电化学方法相比其他分析检测方法，具有设备低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。基于各种电化学方法所研制的电化学生物传感器是ー类以电极作为信号转换器，以电位或电流加以测量的生物传感器。电化学体系借助电极实现电能的输入或输出，从而获得电极表面修饰物质的电信号，常用的为三电极体系。三电极体系包括工作电极、辅助电极(也称对电极)和參比电极，其中的对电极是钼电极，參比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电扱，电流流经工作电极和对电扱。工作电极所测得的电位是相对于參比电极而言。在各种类型的电化学生物传感器中，酶生物传感器由于酶自身的选择性和灵敏性等优点，近几年来得到了极大的发展。酶的固定方法直接决定了酶在传感器中活性的高低，从而显著地影响着酶生物传感器的检测性能。众所周知，大多数酶的催化中心深埋在酶蛋白内部，并且由于酶蛋白在电极表面的不规则定向和吸附变性等原因，酶蛋白大分子在未经修饰的电极表面表现出较慢的异相电子传递速率。为解决这ー难题，研究人员发展了很多类型的修饰电极，利用各种膜材料比如表面活性剤、聚合物、脂类来固定酶蛋白，并且为酶蛋白提供一个合适的微环境来加速酶与电极之间的电子传递。然而，酶在这些修饰材料中的分布仍然是比较无序的。因此，如何使酶定向有序地固定在电极上，从而实现酶催化活性的最优化，是研制新型酶生物传感器亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之ー在于提供ー种检测过氧化氢的生物电化学传感器，该传感器基于多肽矩阵对辣根过氧化物酶(HRP)的特异性结合及对酶活性的促进作用，实现酶传感器中酶在电极表面的特异性定向，从而达到提高传感器灵敏性的目的。本专利技术的目的之ニ在于提供该传感器的制备方法。为达到上述目的，本专利技术采用如下机理某些特定序列的多肽可以与ー些酶，如HRP的特定位点特异性结合，通过调整酶的定向，使酶的活性中心暴露在外，从而促进酶的活性。根据上述机理，本专利技术采用如下技术方案ー种检测过氧化氢的生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其中对电极是钼电扱，參比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于所述的金电极表面构建有多肽矩阵，辣根过氧化物酶HRP通过多肽矩阵定向固定到电极上；所述的多肽的序列为AHKVVPQRQIRHAYNRYGSC ;所述的多肽和辣根过氧化物酶的摩尔比为5 :1 I :5。一种制备上述的检测过氧化氢的生物电化学传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为 a.将处理过的金电极置于0.5 M H2SO4中，在0-1. 6 V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为100 mV/s，直至达到稳定，在氮气氛围内干燥； b.将步骤a所得金电极浸没在多肽溶液中，室温放置15 20小时；然后超纯水冲洗，以去除金表面未共价结合的多肽，随后，将电极浸没在含有I mM巯基己醇的、pH为6.0的N- (2-羟こ基)哌嗪-N’ -2-こ烷磺酸HEPES溶液中0. 5 I小时，用超纯水冲洗，在氮气氛围内干燥，即得到多肽修饰的金电极；所述的多肽溶液含有I剛-10 MM多肽，20 mMHEPES 和 10 mM TCEP,其 pH 为 6. 0 ; c.在密闭状态下，将步骤b所得到的金电极浸没在Img/mL -10 mg/mL的HRP溶液中，室温孵育2 . 5 3. 5h ;再用超纯水洗涤，即得到所需的工作电极； d.将步骤c所得到的工作电极与钼电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的生物电化学传感器。上述的金电极的处理方法具体为将待处理的金电极置于水虎鱼溶液，即浓硫酸30%H202的体积比为3 I，中浸泡2分钟以去除吸附在电极表面的有机物，用超纯水充分冲洗干净；随后将金电极用5000目的细刚玉砂纸打磨，然后分别在含有粒度分别为IPm,0.3 um,0. 05 U m的氧化铝砂浆的丝绸上依次抛光至镜面，抛光后的金电极分别在こ醇和水中超声清洗5分钟。ー种检测过氧化氢的方法，采用上述的生物电化学传感器进行检测，其特征在于该方法的具体步骤为在惰性气氛下，将工作电极浸入含有待检测液的缓冲液中，室温下采用循环伏安法或计时安培法进行电化学扫描，所述的缓冲液采用100 mM、pH为7. 0的PBS缓冲液，其中加入有10 mM的邻苯二胺；采用循环伏安法时的扫描速率为100 mV/s，扫描电压为-0. 4 V -0. 8 V ;采用计时安培法时的工作电位-583 mV。本专利技术选取对HRP的酶活性有促进作用的多肽(多肽序列为AHKVVPQRQIRHAYNRYGSC)，在金电极表面构建该多肽的ー个矩阵，然后利用多肽与HRP的特异性结合作用，将HRP定向固定到电极表面。在检测过程中，在待检测体系中引入了ー种电子导体——邻苯ニ胺，它起到酶和电极间电子传递的桥梁作用。在HRP的作用下，邻苯ニ胺提供电子还原过氧化氢，自身被氧化为具有电化学活性的2，2’ - ニ胺基偶氮苯，可被电化学方法所检测，从而取得了满意的检测结果。本专利技术构建了ー种利用多肽矩阵和辣根过氧化物酶的新型过氧化氢生物电化学传感器。它是基于某些特异性序列的多肽对辣根过氧化物酶的定向结合和对其酶活性的促进作用，将酶定向有序地固定在电极表面，从而解决了传统的酶电化学传感器所不能解决的酶的定向性问题，促进了酶在电极表面的电子传递，从而极大地提高了过氧化氢检测的灵敏性。本专利技术对于酶在电极表面的定向固定这ー课题具有重大意义。附图说明图I为在含有10 mM邻苯ニ胺的100 mM PBS (pH 7. 0)溶液的循环伏安图，其中a为仅修饰了多肽的金电极；b为同时修饰了 HRP和多肽的金电极。图2为在含有10 mM邻苯ニ胺的100 mM PBS (pH 7. 0)溶液中，HRP及多肽修饰的金电极的循环伏安图，其中a为不含H2O2 ；b为含有I mM H2O2条件下。图3为向含有10 mM邻苯ニ胺的100 mM PBS (pH 7. 0)溶液中，连续加入H2O2 (浓度IX 10_9 2X 10_4 M)的条件下，HRP及多肽修饰的金电极的计时安培曲线。插入图为H2O2浓度在IX 10_9 IX 10_5 M范围内的计时安培曲线。 图4为缓冲液中H2O2浓度与电流的线性关系。具体实施例方式实施例一多肽修饰的金电极的制备 将待处理的金电极置于水虎鱼溶液(浓硫酸30%H202 = 3 I)中浸泡2分钟以去除吸附在电极表面的有机物，用超纯水充分冲洗干净。随后将金电极用细刚玉砂纸(5000目)打磨，然后分别在含有氧化铝(粒度分别为I um，0.3 um,0. 05 U m)砂浆的丝绸上依次抛光至镜面，抛光后的金电极分别在こ醇和水中超声清洗5分钟。最后将电极置于0.5 M H2SO4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测银离子的生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其中对电极是钼电扱，參比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于所述的金电极上修饰有模板DNA，模板 DNA 的序列为5’-CCTA CGACTGGATGACGATCCCTACGACTGAAAAAAAAAAAA-C6_SH -3’，该模板DNA在金电极上的修饰密度为1. 2 X IO12个分子/平方厘米 I. 2 X IO13个分子/平方厘米。2.一种制备根据权利要求I所述的检测银离子的生物传感器的方法，其特征在于制备该传感器的工作电极的具体步骤为 a.将处理过的金电极置于0.5 M H2SO4中，在0 I. 55 V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为100 mV/s，直至达到稳定； b.用氮气吹干步骤a所得金电极后，将该金电极浸没在缓冲溶液中，倒置15 18小时后，再浸没在I mM巯基己醇水溶液中反应0. 5 I. 5小时，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，即得到模板DNA链修饰的金电极；所述的缓冲溶液中含有浓度为I U M的模板DNA链、10 mM 的 Tris-HClUO mM 的 TCEP 以及 0. I M 的 NaCl，溶液的 pH 为 I. 4。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的金电极的处理方法的具体步骤为在待处理的金电极表面滴20 y L水虎鱼溶液，即浓硫酸过氧化氢的体积比为3 :1，反应2min，用超纯水冲洗干净，氮气吹干；将金电极在5000目砂纸上打磨5 min之...

【专利技术属性】
技术研发人员：李根喜，朱小立，闫雅琳，贺晓琳，孙丽亚，范琦，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：