一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法技术

本发明专利技术公开了纯化荚膜多糖的方法，包括：将荚膜细菌发酵液离心，收集上清液，超滤浓缩，乙醇沉淀，收集上清液；乙醇沉淀，收集沉淀，注射水复溶；加入蛋白酶酶解，超滤蛋白酶解液；加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.2％-0.3％，离心，收集上清液；加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.1％-0.15％，离心，收集沉淀，溶解沉淀；加入乙醇沉淀，收集沉淀，注射水复溶；超滤，膜过滤。本发明专利技术的纯化方法荚膜多糖回收率高，蛋白质及核酸含量低，去除了传统提纯中利用有毒有机试剂的步骤，简化了纯化步骤，节省了时间和成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于疫苗生产制备领域，涉及ー种纯化荚膜多糖的方法，具体地涉及ー种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法。
技术介绍
近年来的研究表明，侵袭性b型流感嗜血杆菌(Hib)，脑膜炎奈瑟氏球菌以及肺炎球菌已成为我国儿童呼吸道的主要致病菌，引起下呼吸道感染、肺炎、中耳炎、脑膜炎等多种疾病，2岁以下幼儿感染率较高。在20世纪70年代，WHO就制定了 Hib、脑膜炎奈瑟氏球菌以及肺炎球菌等相关细菌荚膜多糖疫苗的制检规程，又于1980年进行了修订，使得这些多糖疫苗的生产得到了规范。现在主要的荚膜多糖的纯化工艺中往往加入酚、氯仿、丙酮等有机试剂以去除蛋 白，这些物质不能被直接的降解，对于人体和环境有很大的危害。一旦这些物质在多糖制剂中不能完全去除，很容易对人体造成伤害；同时这些有机试剂在纯化过程中需要多次使用，不仅增加了操作步骤和操作时间，而且提高了生产过程中的成本。如何減少或去除该类有机试剂的使用，简化工艺步骤，节省时间，同时提高荚膜多糖回收率高，降低蛋白质及核酸含量，是本领域研究人员一直努力解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，该方法不使用酚、氯仿、丙酮等有机试剂，简化工艺步骤，节省时间，同时提高荚膜多糖回收率高，降低了蛋白质及核酸含量。为了达到上述目的，本专利技术提供了下列技术方案本专利技术提供了，其特征在于该方法包括下列步骤a.将荚膜细菌发酵液离心，收集上清液，超滤浓缩上清液，加入こ醇沉淀，使该こ醇的体积百分比终浓度为20% -45%，收集上清液；b.加入こ醇沉淀，使该こ醇的体积百分比终浓度为70% -95%，收集沉淀，用注射水复溶，得复溶液；C.加入蛋白酶，得蛋白酶解液，超滤蛋白酶解液，得超滤液；d.加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.2% -0.3%，离心，收集上清液；e.加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.1% -0. 15%，离心，收集沉淀，溶解沉淀；f.加入こ醇沉淀，该こ醇的体积百分比终浓度为70% -95%，收集沉淀，用注射水复溶，得复溶液；g.将步骤f中所得的复溶液进行超滤，膜过滤，得到纯化的荚膜多糖。本专利技术的，其特征在于步骤a中超滤浓缩上清液后，加入こ醇沉淀之前，还包括下列步骤加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为然后调节pH值为4-6. 5。本专利技术的，其特征在于步骤a和步骤b之间还包括下列步骤加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为5%-25%，然后调节pH值为4-6. 5。本专利技术的，其特征在于步骤c中的蛋白酶是蛋白酶K、胰蛋白酶、 木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中ー种或多种。本专利技术的，其特征在于步骤b和步骤c之间还包括下列步骤加入Tris，使得其终浓度为10mM-500mM，调节pH到6_9。本专利技术的，其特征在于步骤c得蛋白酶解液后，超滤蛋白酶解液之前，还包括下列步骤搅拌后加入IOmM-IOOmM PB S溶液。本专利技术的，其特征在于步骤d和e中所加入的十六烷基三甲基溴化铵的质量百分比浓度是0. 1% -2.0%。本专利技术的，其特征在于步骤e中溶解沉淀使用浓度为0. 2M-2. OM KCl、0. 2M-2. OM NaCl或0. 2M-2. OM CaCl2中的ー种或多种溶解沉淀。本专利技术的，其特征在于步骤e和步骤f 之间还包括下列步骤加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为5%-25%，然后调节pH值为4-6. 5。本专利技术的，其特征在于所述的荚膜细菌选自下列之一 B型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌或肺炎球菌。本专利技术的从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法去掉了酚、氯仿、丙酮等有机试剂的加入，而是使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)这种相对对于人体伤害较小的物质进行了代替，而且CTAB易于被降解，从而对环境的影响大大減少。与此同时简化了纯化步骤，节省了时间和生产成本。同时提高荚膜多糖回收率高，降低了蛋白质及核酸含量。为了更好地理解本专利技术，下面通过实施例对本专利技术做进ー步说明。该实施例仅仅是示例，本专利技术不限于该实施例。本专利技术所用的生物材料、试剂、方法和仪器，如无特别说明，为本领域常规的生物材料、试剂、方法和仪器。本专利技术所涉及的生物材料、试剂、方法和仪器均可以通过商购途径购买。具体实施例方式实施例I :从B型流感嗜血杆菌发酵液纯化荚膜多糖I.菌种Hib菌株购自ATCC，菌种编号为51654 ；2.培养基丽SM I培养基，丽SM II培养基，M⑶M I培养基；3.细菌培养将菌种干粉使用相应培养基溶化后，涂布于巧克カ血平板上，在ニ氧化碳培养箱中培养过夜，将菌体刮下后放入ー级种子摇瓶中培养4小时，然后将菌液放入50L发酵罐中培养16小时，最后使用甲醛灭活。4.纯化荚膜多糖通过离心和超滤浓缩将发酵液体积浓缩10倍后，加入醋酸钠使其质量百分比浓度为1%，调pH值为4，加入预先冷却的无水こ醇使之体积百分比终浓度为20%，4°C静置4小时以上，离心，弃沉淀，上清中加入醋酸钠至其质量百分比终浓度达5%，调pH值为4，加入预先冷却的无水こ醇使之体积百分比终浓度为70%，4°C静置4小时以上，离心，收集沉淀并用注射水复溶，离心，弃去不溶物。向上清中加入Tris，使 得其终浓度为10mM，HCl调节pH到6，加入蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶以及枯草杆菌酶蛋白酶，37°C搅拌2小时后用IOmM PBS溶液(pH7. 0，IOmMNaCl)超滤10倍体积。超滤液中加入质量百分比浓度0. 1% CTAB和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0. 2%，4°C静置4小时以上，离心，弃沉淀。离心上清等体积稀释2倍后，加入质量百分比浓度0. 1% CTAB，4°C静置4小时，离心，弃上清，沉淀用0. 2M KCl复溶。加入5%醋酸钠，调pH值为4，加入预先冷却的无水こ醇使之体积百分比浓度为70%，4°C静置4小时以上，离心，收集沉淀，注射水复溶。沉淀复溶后用注射水超滤10倍体积。经0. 22um膜过滤，_20°C保存。5.多糖检测Hib多糖检测方法參见《中华人名共和国药典(2010)》附录VIII J，D-核糖检查法；Hib多糖回收率=最终产品浓度X最终体积_ X 100%；起始浓度X起始体积6.残留蛋白质和核算的测定蛋白检测方法參见《中华人名共和国药典(2010)》附录VI B，Iowery法；核酸检测方法參见《中华人名共和国药典(2010)》附录II A，紫外-可见光光度法;表一 Hib多糖纯化产物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于该方法包括下列步骤 a.将荚膜细菌发酵液离心，收集上清液，超滤浓缩上清液，加入こ醇沉淀，使该こ醇的体积百分比终浓度为20% -45%，收集上清液； b.加入こ醇沉淀，使该こ醇的体积百分比终浓度为70%-95%，收集沉淀，用注射水复溶，得复溶液； c.加入蛋白酶，得蛋白酶解液，超滤蛋白酶解液，得超滤液； d.加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.2% -0. 3%，离心，收集上清液； e.加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0. 1% -0. 15%，离心，收集沉淀，溶解沉淀； f.加入こ醇沉淀，该こ醇的体积百分比终浓度为70%-95%，收集沉淀，用注射水复溶，得复溶液； g.将步骤f 中所得的复溶液进行超滤，膜过滤，得到纯化的荚膜多糖。2.根据权利要求I所述的ー种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于步骤a中超滤浓缩上清液后，加入こ醇沉淀之前，还包括下列步骤加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为1% _5%，然后调节pH值为4-6. 5。3.根据权利要求I所述的ー种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于步骤a和步骤b之间还包括下列步骤加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为5% -25%,然后调节pH值为4-6. 5。4.根据权利要求I...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱涛，钟玥如，郝擘，
申请(专利权)人：天津康希诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：