本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及利用大肠埃希氏菌BA305发酵生产丁二酸的方法。通过提高大肠埃希氏菌BA305对ATP的供给，在两阶段发酵过程中提高丁二酸生产效率，并在循环利用细胞产丁二酸的过程中，保持生产性能，延长丁二酸生产能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及利用大肠埃希氏菌BA305发酵生产丁ニ酸的方法，具体的，是利用高效循环利用细胞产丁ニ酸基因工程菌发酵生产丁ニ酸的方法，通过提高ATP供给，在两阶段发酵过程中提高丁ニ酸生产效率，并在循环利用细胞产丁ニ酸的过程中，保持生产性能，延长丁ニ酸生产能力。
技术介绍
丁ニ酸(succinic acid)又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1，4-丁ニ醇、四氢呋喃、Y-丁内酯等有机化学品以及聚丁ニ酸丁ニ醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。丁ニ酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2,能有效缓解温室效应，开辟了温室气体ニ氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁ニ酸的生产菌株主要集中在AnaerobiospiriIlum succiniciproducens、ActinobaciIius succinogenes> Mannheimia ■syeeifliei/Trooweefls'SL组谷孰酸棒杆菌ネロ重组大肠杆菌。其中利用野生菌株生产丁ニ酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、こ酸等副产物积累较多，阻碍了其エ业化进程。而重组大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁ニ酸优秀菌株。在大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)生成草酰こ酸，在此过程中没有ATP的生成，但是在ガsubtil is中，磷酸烯醇式丙酮酸是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)生成草酰こ酸的，在此过程中有ATP的生成，并且Millard等在大肠杆菌中过量表达万.coli 和/研究发现过量表达可以使琥拍酸作为混合酸发酵的主要产物，且产量较出发菌株提高3. 5倍，而过量表达/7^对发酵结果没有影响，但在/7/7C缺陷菌株中，/的过量表达能够提高琥珀酸的产量，这是由于PPC的Km比PCK小100倍，因此只有在/7/7C缺陷菌株中，/的过量表达才能够提高琥珀酸的产量。玉米芯是农业生产中比较常见的废弃物，由于其成分含有大量纤维素，因此其水解液对微生物发酵来说，是ー种很好的可持续利用的绿色碳源，但其稀酸水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁ニ酸大肠杆菌不能利用玉米芯水解液发酵生产丁ニ酸。姜岷等将玉米芯按料液比1:5 (质量体积比)配制玉米芯料液，物料粒径250 380 u m, H2SO4用量3% (体积分数)，水解温度126°C，反应时间215 h，利用活性炭吸附及Ca(OH)2中和等方式，对玉米芯多组分糖液进行脱毒脱盐处理，总糖质量浓度为50 g/L，其中木糖占80%以上。稻草秸杆是重要的ー类可再生生物质资源。目前，除了在造纸业エ业方面的利用，绝大多数被废弃，严重浪费了资源并且污染了环境。其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，因此其水解液对微生物发酵来说，是ー种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁ニ酸大肠杆菌不能利用稻草秸杆水解液发酵生产丁ニ酸，陶文沂等通过稀硫酸121°C处理稻草秸杆I h，再用20 g/L的NaOH于121°C处理秸杆lh，葡萄糖和木糖二者总质量浓度达50 g/L左右。甘蔗渣是甘蔗制糖时榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液对微生物发酵来说，是ー种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁ニ酸大肠杆菌不能利用稻草秸杆水解液发酵生产丁ニ酸，约含有50%的纤维素通过粉碎以及碱/氧化法预处理可得到总糖质量为50 g/L，其中木糖占80%以上。糖蜜是エ业制糖过程中，蔗糖结晶后，剰余的不能结晶，但仍含有较多糖的液体残留物。余炜等将糖蜜与水1:1混匀，用浓硫酸(5 mol/L)将其pH调至2. 0，于100°C加热20min，并用15%的石灰乳中和处理，总糖质量为600 g/L，葡萄糖和果糖各占50%。利用大肠杆菌生产丁ニ酸的发酵模式主要包括专ー性厌氧发酵及两阶段发酵。专ー性厌氧发酵时，菌株生长缓慢，丁ニ酸终浓度和收率低。Vemuri等人利用大肠杆菌AFPlll (PYC)两阶段发酵，其厌氧阶段可完成I. lg/g的丁ニ酸收率和I. 3 g/(L*h)的丁ニ酸生产强度(Applied Envirmental Microbiology. 2002,68,1715-1727)。但如果考虑有氧阶段消耗的糖及花费的时间，收率和生产强度下降。Andersson等人通过及时回收厌氧发酵细胞并转化新鮮培养基继续厌氧丁ニ酸生产，解除了产物抑制，延长了丁ニ酸的生产时间，在相同时间内较两阶段发酵，产物浓度提高了 60% ;但由于厌氧发酵过程中ATP供给不足，菌体密度、细胞比生产强度都不断下降(Bioprocess and Biosystems Engineering.2010, 33，711-718)。因此，若能提高ATP的供给，将可大幅度提高菌体厌氧发酵能力，保持细胞比生产强度，延长丁ニ酸发酵时间。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了ー种高效循环利用细胞产丁ニ酸基因工程菌的构建及其发酵生产丁ニ酸的方法，具体是ー株产丁ニ酸基因工程菌，通过提高ATP供给，在两阶段发酵过程中提高丁ニ酸生产效率，并在循环利用细胞产丁ニ酸的过程中，保持生产性能，延长丁ニ酸生产能力。为实现本专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案 一、本专利技术提供一株产丁ニ酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌(.Escherichia co/i ) BA305，其保藏号登记号为 CCTCC NO :M2012102。本专利技术所述的大肠埃希氏菌BA305的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和磷酸转运系统(PTS)中的/基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)后，得到高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长并产丁ニ酸的大肠埃希氏菌BA305。重组菌株大肠埃希氏菌BA305的代谢途径如图I所示。进ー步地,所述的具体构建步骤如下 (I)以缺乏乳酸脱氢酶基因(A/が)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7ガ)活性的^:NZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和PTS转运系统中的/7tsG基因，得到同时缺乏IdhA、pflB、ppc和PtsG的感受态菌株； (2)纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(Pd)基因，构建得到过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒； (3)将步骤(2)所述的质粒导入步骤(I)得到的感受态菌株，获得阳性转化子； (4)利用步骤(3)的阳性转化子过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，以及各种比例混合糖和纤维素水解液的能力，得到高效利用葡萄糖、本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种利用大肠埃希氏菌(&cA6 ricAia co/i)BA305发酵生产丁ニ酸的方法,其特征在于循环利用重组大肠杆菌细胞生产丁ニ酸 (1)利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁ニ酸 用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌BA305接种入发酵罐，发酵培养基为LB培养基并添加碳源，通入空气或纯氧进行有氧培养，当有氧培养菌体0D_至O. 4 O. 6用O. 3 mM的IPTG诱导，继续有氧培养15h至0D_=19，停止通入空气或纯氧，通入CO2并添加碳源进行厌氧发酵产酸，同时添加中和剂调控pH值6. 4-6. 8 ； (2)当步骤(I)的培养基中测定无...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜岷，梁丽亚，刘嵘明，马江锋，陈可泉，韦萍，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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