本发明专利技术公开了转化野生型枯草芽孢杆菌的方法。本发明专利技术提供的方法包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤；所述制备感受态细胞依次包括如下步骤：（1）将野生型枯草芽孢杆菌接种至生长培养基，使野生型枯草芽孢杆菌的初始浓度为1.8×107-7.7×107CFU/mL，35-37℃振荡培养2-3.5h；（2)将1体积份完成步骤(1)的培养体系与0.8-1.2体积份诱导培养基混匀，35-37℃振荡培养1.5-3.5h；所述电击转化包括如下步骤：将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，然后采用1.2-1.8kV的电压进行电击，得到导入所述待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。本发明专利技术提供的方法，转化效果好，操作简便。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌转化领域，具体的涉及ー种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法。
技术介绍
枯草芽孢杆菌是ー种革兰氏阳性细菌，广泛存在于自然界中，很多植物内生和土壤习居枯草芽孢杆菌是潜在的植物病害生物防治因子，建立相应转化体系是对菌株进行荧光标记以原位监测其定殖、分布规律的前提。转化是指细菌摄取外界环境中DNA的过程，细菌能够通过自然转化适应复杂的外界环境，转化的发生可能会造成基因克隆、突变体产生和基因图谱等现象。枯草芽孢杆菌转化机制研究表明，细胞感应外界信号后经过一系列调控途径诱导感受态形成因子ComK的产生，ComK再调控一系列后期感受态形成基因(late competencegenes)表达，这些基因编码细胞膜上识别并接受外源DNA的复合体和胞内保护酶等产物，目前所有转化的发生都需要细胞处于感受状态，这样才可能转化成功，因此制备性能良好的感受态细胞是实现枯草芽孢杆菌转化的关键步骤。传统转化方法很难在实验室条件下实现野生型枯草芽孢杆菌的人工转化，许多已经成功转化的菌株是经过遗传改良或是适应了实验室条件的菌株。对于野生型枯草芽孢杆菌人工转化来说，现有的方法主要是自然转化法、原生质体转化法和传统电击转化法等。自然转化法操作简单，但成功率极低，该方法中的培养基诱导细胞进入感受状态这一歩十分关键，加入质粒后发生自然转化的概率很低。原生质体转化法转化率相对较高，但步骤繁琐，加入溶菌酶的量及处理时间、聚こニ醇(PEG)的处理方法及处理时间、细胞壁的再生及转化子筛选等步骤非常关键，很难把握。传统电击转化法使用较多，操作相对简便，但转化效率不高，电压(电容与电阻的设置)和时间常数是关键參数。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供的转化野生型枯草芽孢杆菌的方法，包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤；所述制备感受态细胞依次包括如下步骤(I)将野生型枯草芽孢杆菌接种至生长培养基，使野生型枯草芽孢杆菌的初始浓度为 I. 8X 107-7. 7X 107cfu/mL (如 I. 8 X 107_5 X 107CFU/mL 或 5 X 107_7. 7 X 107CFU/mL)，35-37°C (如35-36°C或36-37°C )振荡培养2-3. 5h (如2_3h或3-3. 5h);所述生长培养基的溶剂为水(如双蒸水)，溶质及其浓度如下硫酸铵I. 8-2. 2g/L (如I. 8-2g/L或2_2. 2g/U、磷酸氢ニ钾 14-16g/L (如 14-14. 8g/L 或 14. 8_16g/L)、柠檬酸三钠 I. 5-2. 5g/L (如I. 5-1. 9g/L 或 I. 9-2. 5g/L)、硫酸镁 0. 09-0. lg/L(如 0. 09-0. 098g/L 或 0. 098-0. lg/L)、葡萄糖 4. 8-5. 2g/L(如 4. 8-5g/L 或 5_5. 2g/L)和酪蛋白水解物 0. 18-0. 22g/L(如 0. 18-0. 2g/L 或 0. 2-0. 22g/L)；(2)将I体积份完成步骤(I)的培养体系与0. 8-1. 2体积份(如0. 8-1体积份或1-1.2体积份)诱导培养基混匀，35-37°C (如35-360C^ 36-37°C )振荡培养I. 5-3. 5h (如I. 5-3h或3-3. 5h);所述诱导培养基的溶剂为水(如双蒸水)，溶质及其浓度如下硫酸铵I.8-2. 2g/L(如 I. 8-2g/L 或 2-2. 2g/L)、磷酸氢ニ钾 14_16g/L(如 14-14. 8g/L 或 14. 8_16g/U、柠檬酸三钠 I. 5-2. 5g/L ( 如 I. 5-1. 9g/L 或 I. 9-2. 5g/L)、硫酸镁 0. 09-0. lg/L (如0. 09-0. 098g/L 或 0. 098-0. lg/L)和葡萄糖 4. 8-5. 2g/L (如 4. 8_5g/L 或 5-5. 2g/L)；所述电击转化包括如下步骤将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，然后采用I. 2-1. 8kV (如I. 2-1. 5kV或I. 5-1. 8kV)的电压进行电击，得到导入所述待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。所述待转化质粒与所述感受态细胞的配比为100ng-5i! g (如100ng-2 i! g或2-5u g)所述待转化质粒:0. 2X IO9CFU-O. 49X IO9CFU (如 0. 2X IO9CFU-O. 31 X IO9CFU 或0. 31 X IO9CFU-O. 49 X IO9CFU)感受态细胞。所述制备感受态细胞还包括如下步骤(3):将完成所述步骤(2)的培养体系冰浴30min，然后4°C离心收集细胞。所述离心的条件具体可为5000r/min离心lOmin。所述制备感受态细胞还包括如下步骤完成所述步骤(3)后，依次用4°C预冷的双蒸水和4°C预冷的HEPES缓冲液清洗所述细胞，然后用4°C预冷HEPES甘油缓冲液重悬细胞，即为感受态细胞。HEPES缓冲液(lmM，pH7. 0)的制备方法将0. 238g HEPES用双蒸水溶解并定容至IしHEPES甘油缓冲液(lmM，pH7. 0)的制备方法将0. 238g HEPES固体粉末、IOOmL甘油和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至1L。所述电击转化中，所述冰浴的时间具体可为30min。所述电击转化中，所述电击的电阻具体可为200 Q、电容具体可为25ii F。所述电击转化还包括所述在电击后进行如下处理的步骤向电击杯中加入700-1000 u L (如700-800 y L或800-1000 u L)30_37°C预热的LB液体培养基并混匀，然后30-37°C振荡培养3h。LB液体培养基(pH7. 2)的制备方法将IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg氯化钠和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至1し所述待转化的质粒具体可为穿梭载体pBE2、穿梭载体pS4GFP或穿梭载体pMarA。所述野生型枯草芽孢杆菌可为未经过遗传工程改造的枯草芽孢杆菌。所述枯草芽孢杆菌具体可为枯草芽孢杆菌9407。以上任一所述的振荡具体可采用如下条件150-220r/min,如150_180r/min或180_220r/min。所述振荡的半径具体可为12mm。枯草芽孢杆菌在指数生长后期会有约10-20%的细胞进入感受态，尤其在营养贫乏的培养基中易形成感受态细胞，例如以葡萄糖为唯一碳源的无机盐培养基。本专利技术针对常规枯草芽孢杆菌转化方法用于野生型枯草芽孢杆菌时所存在的操作繁琐、成功率低、周期长、转化效率低等问题，提供了一种简便易行的野生型枯草芽孢杆菌快速转化新方法，该方法依托枯草芽孢杆菌的自然转化原理，思路清晰，操作简便，转化效果好，为对菌株进行荧光标记以原位监测其定殖、分布规律奠定了基础，为进一歩的遗传操作打下基础。本专利技术可在野生型枯草芽孢杆菌转化上应用，前景广阔。附图说明图I为穿梭载体pBE2的结构示意图。图2为实施例I中的EcoR I单酶切鉴定结果；1为穿梭载体pBE2 (阳性对照)，2和3分别为从两个不同纯培养菌株中提取的质粒，M为Ikb DNA ladder。图3为穿梭载体pMarA的结构示意图。 图4为实施例2中的Pst I ,Kpn I和本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法，包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤； 所述制备感受态细胞依次包括如下步骤 (1)将野生型枯草芽孢杆菌接种至生长培养基，使野生型枯草芽孢杆菌的初始浓度为1.8X 107-7. 7X 107CFU/mL，35-37°C振荡培养2_3. 5h ;所述生长培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下硫酸铵I. 8-2. 2g/L、磷酸氢ニ钾14-16g/L、柠檬酸三钠I. 5-2. 5g/L、硫酸镁0.09-0. lg/L、葡萄糖 4. 8-5. 2g/L 和酪蛋白水解物 0. 18-0. 22g/L ； (2)将I体积份完成步骤(I)的培养体系与0.8-1. 2体积份诱导培养基混匀，35-37°C振荡培养I. 5-3. 5h ;所述诱导培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下硫酸铵I. 8-2. 2g/L、磷酸氢ニ钾14-16g/L、柠檬酸三钠I. 5-2. 5g/L、硫酸镁0. 09-0. lg/L和葡萄糖4. 8-5. 2g/L ； 所述电击转化包括如下步骤将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，然后采用I. 2-1. SkV的电压进行电击，得到导入所述待...
【专利技术属性】
技术研发人员：王琦，汝津江，李燕，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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