本发明专利技术公开了啤酒花短侧链脂肪酸CoA连接酶CCL2及其编码基因和应用。本发明专利技术提供的蛋白质，来源于(Humulus?lupulus?L.)，命名为CCL2蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酸CoA连接酶功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明专利技术提供的CCL2蛋白，具有CoA连接酶的作用，是苦味酸合成途径所必需的关键因素，通过在酵母中共表达CCL2和VPS基因可以产生苦味酸合成前体PIVP达到2mg/L。本发明专利技术在啤酒酿造工业，人类健康保健等领域有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种啤酒花短侧链脂肪酸CoA连接酶CCL2及其编码基因和应用。
技术介绍
啤酒花(Humulus lupulus L.),也称作忽布、蛇麻花等,是二倍体(2n = 2x = 20)属于蔷薇目大麻科潷草属蛇麻种，是多年生攀缘草本植物，雌雄异株，雌花是由苞片复瓦状排列形成球果状花序，长3-4厘米，内层苞片下面生有大量黄色腺体腺毛。啤酒花雌花主要用于酿造啤酒，是啤酒特有香味和苦味的主要来源，通常被认为是啤酒酿造的“绿色黄金”。2009年全球的啤酒销售额是4700亿美元，中国2008年的啤酒市场销售额大约1000亿人民币，无论是国内国外，啤酒销售市场仍在不断的扩大。啤酒爽口不爽口，很大程度上取决于啤酒花风味品质(其它因素还包括大麦芽和酵母菌株等)。啤酒花作为重要的经济作物而在我国中西部地区(新疆、甘肃、内蒙等地)有大面积种植，是当地农民的主要经济来源。我国啤酒花当前存在的主要生产问题是酒花品种单一，风味品质较差，高档啤酒制造所需酒花仍需要进口，仅在2008年我国就进口了总价值5千万美元的啤酒花。啤酒花风味品质主要是由一些酒花特有的次生代谢物(萜类，苦味酸，黄腐醇)的含量及比例决定的，这些化合物生物合成和积累主要是在啤酒花腺体腺毛中完成。啤酒花香味主要来源于其精油成分，主要包括单職(月桂烯Myrcene)和倍半職(石竹烯Caryophyllene和啤酒花烯Humulene)等。啤酒花苦味主要来源于苦味酸(分为α -，β -两类)，其中α-苦味酸是含有两个异戊烯基团的芳香类化合物的总称(α-苦味酸在啤酒酿造过程中异构化产生苦味物质)，β-苦味酸的成分则是含有三个异戊烯基团芳香类化合物。除此之外，啤酒花腺体腺毛还合成积累大量的异戊烯基化的查耳酮(Prenylchalcone)，包括黄腐醇(Xanthohumol, Xan ；Desmethylxanthohumol, DMX脱甲基黄腐醇)和少量异戍烯基化的黄酮(Prenylflavanone),如6位或8位异戍烯基化的三轻黄烧酮等。(脱甲基)黄腐醇具有抗癌(尤其是前列腺癌)和抗氧化的功效(有效浓度低于10 μ M)，而且没有明显的毒副作用。苦味酸也表现出很好的药用前景，如防止肝脏星形细胞纤维化，诱导肿瘤细胞凋亡，调控人体脂类代谢平衡等功效。黄腐醇和苦味酸的这一系列功效也是当下比较认同“适量饮用啤酒有益健康”的理论基础，从某种意义上啤酒中黄腐醇和苦味酸有些像红葡萄酒中白藜芦醇(Resveratrol)的功效。但是，啤酒中的苦味酸，黄腐醇含量很低，而为达到保健功效成人需每天至少摄入150毫克左右，如何在不增加生产成本(加大啤酒花的使用量理论上可行，但很不经济)的情况下增加啤酒中苦味酸、黄腐醇含量是一个比较棘手的实际生产问题。因此提高啤酒花中苦味酸、黄腐醇含量也是啤酒花育种行业不断追求的目标之一。早期的同位素示踪(13C)实验表明，苦味酸的芳香环母体骨架是由ValeiOphenoneSynthase (VPS)催化一分子的Isovaleryl-CoA和三个分子的Malonyl-CoA反应而成。相应的基因(VPS基因)克隆和功能分析已经完成，尽管VPS基因表达的组织特异性与苦味酸在不同组织中的含量趋势有很好的相关性，但体外生化结果表明VPS基因并不能催化生成PIVP等预期的芳香环类产物，而是生成吡喃酮类副产物，而在啤酒花腺体腺毛中并没有发现吡喃酮类化合物的积累。VPS可能与代谢途径中其它蛋白(可能的候选蛋白包括异戊烯基转移酶，P450等)相互作用组成代谢通道(Metabolic channeling)直接生成苦味酸等终产物，预计的中间代谢产物(如PIVP)等在代谢反应过程中没有被释放出来。芳香类异戊烯基转移酶也是目前次生代谢领域的研究热点，一是因为该酶催化形成碳碳键(通常由于自由能势较高而难以形成)；二是因为异戊烯基化的产物通常比底物有更高的生物活性，应用前景很广泛。推测PIVP经两步异戊烯化反应形成脱氧潷草酮(Deoxyhumulone)，脱氧潷草酮随后经氧化反应生成终产物潷草酮(Humulone)，PIVP经连续三步异戊酰化反应生成蛇麻酮(Lupulone)。 对人类而言，很多植物次生代谢物具有治疗疾病的重要功能，如治疗疟疾的特效药青蒿素，抗癌药物紫杉醇等。到目前为止，植物次生代谢化合物依然是探寻新药的重要方向之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供啤酒花短侧链脂肪酸CoA连接酶CCL2及其编码基因和应用。本专利技术提供的蛋白质,来源于(Humulus lupulus L.),命名为CCL2蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列I的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酸CoA连接酶功能的由(a)衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列 标签残基序列 Poly-Arg5-6(通常为 5 个) RRRRR Poly-His2-10(通常为 6 个) HHHHHH FLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表I所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白的基因(CCL2基因)也属于本专利技术的保护范围。所述CCL2因为如下I) -4)中任一所述的DNA分子I)序列表中序列2自5’末端第I至1719位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)所述的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与I)或2)所述的DNA分子具有90 %以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述严格条件为在O. IXSSPE(或O. I X SSC), O. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王国栋，张凤霞，徐海洋，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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