本发明专利技术公开了一种利用毕赤酵母生产猪Gp96蛋白的方法及专用培养基。本发明专利技术提供的发酵培养基，由如下配比的7种物质组成：酵母膏∶蛋白胨∶biotin∶CaSO4∶MgSO4∶NH4CL∶甲醇为(0.3-1.0)g∶(0.6-1.5)g、4x10-5g、(0.04-0.08)g∶(0.7-1.4)g∶(0.2-0.5)g∶(0.2-1.5)ml。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术提供的发酵培养基，降低了碳氮源的百分含量，降低了发酵成本；培养基中添加了常用的无机离子，不仅强化了工程菌对目的蛋白的表达途径，提高了表达量，而且便于工业化大规模发酵生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种利用毕赤酵母生产猪Gp96蛋白的方法及专用培养基。
技术介绍
Gp96蛋白是内质网热休克蛋白(Heat shork protein,HPS)HPS90家族的代表,是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。Gp96具有高度寡聚结构，其同源寡聚化有利于结合肽段和发挥分子伴侣的功能参与蛋白质的折叠、转运、 合成等过程、并可与细胞内的其它蛋白质结合；参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程；加工提呈肿瘤抗原及维持细胞内环境稳定等作用；对细胞的生长、发育、分化及死亡具有一定的调节作用。在Gp96N末端1-355片段之间有一段重要的氨基酸序列，能与抗原提呈细胞 (antigen presenting cells,APCs)结合,增加抗原肽的提呈,诱导抗原特异性的细胞毒性 T细胞淋巴反应(cytotoxic IympHocyte7CTL),因此这段序列具有充分的免疫活性,能够激活免疫应答，被认为在疫苗制备及抗肿瘤免疫中具有很大的应用前景。有研究表明，Gp96在天然和获得性免疫中均具有重要的作用。在获得性免疫中，Gp96能与APCs的受体结合，通过抗原的交叉呈递作用诱发机体产生特异性的CTL免疫应答，增强CD8+T细胞清除病毒的能力；能通过刺激抗原呈递细胞(DC)和T细胞产生各种细胞因子激活免疫系统。在天然免疫中，Gp96可与Toll样受体(Toll like receptors,TLR)结合,并且能非特异地激活抗原提成细胞，表达TNF- a、IL-12等细胞因子和上调⑶86、⑶80共刺激分子及MHC类分子，给 CTL提供一个促炎性细胞因子环境和共刺激分子，激发免疫应答；另外，Gp96还可特异结合并激活中性粒细胞(PMNs)和单核细胞，增强其吞噬作用，Gp96刺激的PMNs，特别是单核细胞，使之释放大量的IL-8，IL-8作为一种强力PMNs趋化因子，能诱发PMNs的聚集。因此， Gp96在肿瘤发病学、治疗、预防学以及疫苗研发中的意义已引起广泛关注，成为近年来最活跃的研究领域。Thomas等用泡状口炎病毒(VSV)模型在体外证实了 Gp96_肽复合物对⑶8+T淋巴细胞的激活作用。随后，研究显示在体外成功地构建了 Gp96-肽复合物，Gp96是TLRs非常重要的伴侣分子，在巨噬细胞的正常功能发挥中扮演重要的角色。Heikema等把含流感病毒核蛋白(NP)编码序列的质粒转染仓鼠细胞，以Gp96制备物作为疫苗免疫小鼠，产生了针对 NP的细胞免疫应答，提示对于已知抗原，这是一个生产以Gp96为基础的疫苗的很好方式。已经有专利申请号201010140598. 6，专利技术名称为“猪用抗原呈递蛋白及编码基因与应用”，虽然涉及了利用毕赤酵母发酵表达，但是未对发酵培养基及发酵条件进行优化， 培养基中蛋白胨和酵母膏含量高，且需添加YNB，发酵成本较高；另外，因p. pastoris-x33 属于MUT+型酵母，甲醇的添加量对于诱导外源蛋白的表达至关重要，而且甲醇过多，会导致发酵液溶氧量急剧下降，使菌体生长受到抑制，甚至造成菌体死亡；同时，因目的蛋白 Gp96属于糖蛋白，其生物活性和糖基化息息相关，而发酵液的pH对糖基化程度有着重要影响。因此，对发酵培养基和发酵工艺进行合理优化，成为至关重要的研究方向。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种发酵培养基。本专利技术提供的发酵培养基，由如下配比的7种物质组成酵母膏蛋白胨生物素CaSO4 MgSO4 NH4CL 甲醇的配比为(O. 3-1.0) g (0.6-1. 5) g 4xl(T5g (O. 04-0. 08) g (O. 7-1. 4) g (O. 2-0. 5) g (O. 2-1. 5)ml。在上述发酵培养基中，所述酵母膏蛋白胨生物素 (biotin) CaSO4 MgSO4 NH4CL 甲醇的配比为(O. 3 或 O. 5) g : (O. 6 或 I. O) g 4xl(T5g (O. 04、0· 06 或 O. 08)g (O. 7、I. O 或 I. 4) g (O. 2 或 O. 4) g : (O. 2,1. O 或 I. 5)ml ；上述发酵培养基的pH值为5. 5-6. 5。本专利技术的另一个目的是提供一种发酵培养基。本专利技术提供的发酵培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的7种物质组成所述酵母膏在所述发酵培养基中的终浓度为O. 3%-1.0% (质量百分含量)；所述蛋白胨在所述发酵培养基中的终浓度为O. 6%-I. 5% (质量百分含量)；所述生物素在所述发酵培养基中的终浓度为4xl0_5% (质量百分含量)；所述CaSO4在所述发酵培养基中的终浓度为O. 04% -O. 08% (质量百分含量)；所述MgSO4在所述发酵培养基中的终浓度为O. 7% -I. 4% (质量百分含量)；所述NH4CL在所述发酵培养基中的终浓度为O. 2% -O. 5% (质量百分含量)；所述甲醇在所述发酵培养基中的终浓度为O. 2% -I. 5% (体积百分含量)；所述溶剂为水。上述发酵培养基中，所述酵母膏在所述发酵培养基中的终浓度为O. 3%或O. 5% (质量百分含量)；所述蛋白胨在所述发酵培养基中的终浓度为O. 6%或1.0% (质量百分含量)；所述生物素在所述发酵培养基中的终浓度为4xl0_5% (质量百分含量)；所述CaSO4在所述发酵培养基中的终浓度为O. 04%,O. 06%或O. 08% (质量百分含量)；所述MgSO4在所述发酵培养基中的终浓度为O. 7%、1.0%或I. 4% (质量百分含量);所述NH4CL在所述发酵培养基中的终浓度为O. 2%或O. 4% (质量百分含量)；所述甲醇在所述发酵培养基中的终浓度为0.2^^1.0%或1.5% (体积百分含量)O上述发酵培养基的pH值为5. 5-6. 5。本专利技术的第三个目的是提供上述第一个目的中发酵培养基的制备方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤将上述7种物质按照上述配比混合，得到上述第一个目的的发酵培养基。本专利技术的第四个目的是提供上述第二个目的的发酵培养基的制备方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤将上述溶质中的7种物质均溶于水达到上述终浓度，得到上述第二个目的的发酵培养基。本专利技术的第五个目的是提供一种制备Gp96N蛋白的方法。本专利技术提供的方法，为在上述的发酵培养基中发酵工程菌p. pastoris_X33/ pPICZ a A/Gp96N/12,收集发酵产物，即得到Gp96N蛋白；上述工程菌p. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12为将Gp96N蛋白的编码基因通过重组载体导入P.pastoris-X33中得到的重组菌；上述重组载体为pPICZ a A/Gp96N,具体为将Gp96蛋白的编码基因插入pPICZ a A 载体中Xho I和Xba I位点间得到的重组载体；上述Gp96N蛋白为猪Gp96N蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列I。在上述方法中，上述猪Gp96N蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；在上述方法中，上述发酵的温度为28°C，所述发酵的时间为72h_80h ;所述发酵的 pH 为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文军，贾晓娟，陈才伟，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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