一种生物医药技术领域的阿维菌素的优化生产方法，通过构建包含sav933基因和sav934基因的超量表达质粒pFAveT，并将所述的表达质粒转入阿维链霉菌3-115中，实现产量的提高。本发明专利技术在抗生素工业生产菌株里超量表达外排基因以增加特定抗生素的产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种生物医药
的方法，具体是一种。
技术介绍
阿维菌素具有高效、广谱的抗各种线虫和人类寄生虫的活性，被广泛地用于农业和畜牧业的病虫害防治。从阿维链霉菌中共可分离得到八种阿维菌素组分，其中唯一有抗虫活性的是组分Bla。另外，阿维链霉菌在发酵生产的过程中还会产生有毒副产物寡霉素。阿维链霉菌的全基因组测序已经完成，阿维菌素生物合成基因簇也已经克隆定位 (Ikeda H, Ishikawa J, Hanamoto A, Shinose M, Kikuchi H, Shiba T, Sakaki Y, Hattori M, Omura S. Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis.(对工业微生物阿维链霉菌进行完整的基因组测序和比较分析)Nat Biotechnol2003,21 :526-531) 0但是目前很多调节阿维菌素产量的因子尚不知其功能。虽然已有不少关于提高阿维菌素产量的研究，但是目前还没有基于提高阿维菌素的外排效率来提高其产量的研究。腺苷三磷酸结合盒转运蛋白，由于含有一个腺苷三磷酸结合盒(ATP-binding cassette, ABC)而得名，可简称为ABC转运蛋白。ABC转运蛋白是膜整合蛋白，它利用水解ATP的能量对溶质中各种生物分子进行跨膜转运。其转运的底物包括糖、氨基酸、 金属离子、多肽、蛋白质、细胞代谢产物和药物等(Hollenstein K，Dawson RJ, Locher KP. Structure and mechanism of ABC transporter proteins. (ABC 转运蛋白的结构禾口机制)Curr Opin Struc Biol2007，17 :412-418)。ABC转运蛋白的核心结构通常由4个结构域组成，包括2个高度疏水的跨膜结构域(Transmembrane domain，TMD)，禾口 2 个核苷酸结合域(Nucleotide-binding domain， NBD)。TMD和NBD结构域只有在形成二聚体时才具有转运活性。真核生物的ABC转运蛋白比较常见的是，4个不同的结构域位于同一条多肽链上，称为“全分子”ABC转运蛋白；2个结构域在1个亚基上(1个TMD与1个NBD融合)的情况也会发生，称为“半分子” ABC转运蛋白。而在原核生物中，常见的是每1个结构域构成1个亚基，称为“1/4分子”ABC转运蛋白，但也会存在1个亚基上具有2个或2个以上的结构域(Kerr ID, Jones PM, George AM. Multidrug efflux pumps :the structures of prokaryotic ATP-binding cassette transporter efflux pumps and implications for our understanding of eukaryotic P-glycoproteins and homologues.(多药物外排蛋白原核生物ABC外排蛋白的结构及其对于理解真核生物P-糖蛋白与其同源物的启示)FEBS J 2010,277:550-563)。ABC转运蛋白广泛存在于真核和原核生物中，目前已知人类基因组中有48个ABC 转运蛋白超家族成员。在大肠杆菌K-12基因组中，至少有80个编码ABC转运蛋白的基因， 约占基因组的5%。近些年，对于ABC转运蛋白的研究热点主要集中在与多药耐药性(Multidrugresistance,MDR)相关的人类ABC转运蛋白上。肿瘤细胞的MDR是导致化疗失败的主要原因。早期的研究发现，MDR与细胞膜上某些蛋白的表达水平密切相关，由此找到了第一个与 MDR相关的人类ABC转运蛋白——P-糖蛋白(P-glycoproteimPgp)。随后，研究者们又发现了以多种机制参与MDR形成的其它ABC转运蛋白均具有药物排出泵的功能。现在人们将肿瘤细胞MDR的主要原因归于一个高度保守(从细菌到人类)的跨膜蛋白家族某些成员的过度表达，而这个家族正是ABC转运蛋白超家族。对全基因组已测序的阿维链霉菌进行生物信息学的分析。结果发现，在阿维链霉菌的基因组里包含NBD结构域的蛋白有148个，包含TMD结构域的蛋白有183个，约占基因组的4.4%。阿维链霉菌拥有如此众多的ABC转运蛋白基因主要有两个原因。一是它能产生多种次生代谢产物。从阿维链霉菌中能分离到大环内酯、萜类等多种不同的次生代谢产物，如果不跨膜转运出细胞质或者通过区室化使其离开细胞质，则其中大多数都会对链霉菌本身产生毒害作用。二是链霉菌直接接触的环境中化合物丰富，化学成分极其复杂，很多化合物对其具有毒性。跨膜转运一些对细胞有毒的物质对细胞的存活至关重要，而ABC转运蛋白可能在其中起着重要作用。sav933, sav934是位于阿维菌素生物合成基因簇上游的两个基因，紧邻全局调控因子 aveR(Kitani S, Ikeda H, Sakamoto Τ, Noguchi S, Nihira Τ. Characterization of a regulatory gene, aveR, for the biosynthesis of avermectin in Streptomyces avermitilis.(阐明阿维链霉菌中一个与阿维菌素生物合成相关的调控基因aveR)Appl Microbiol Biotech 2009，82 1089-1096)。对 sav933、sav934 进行生物信息学的分析，推测它们编码的产物是属于ABC转运蛋白家族。sav933编码一个核苷酸结合域(NBD)，推测它是位于胞内的ABC转运蛋白ATP结合亚基。sav934编码一个跨膜结构域(TMD)，具有6 个典型的跨膜区，推测它是ABC转运蛋白跨膜亚基。它们是典型的原核生物“每1个结构域构成1个亚基”模式。1个跨膜结构域TMD和1个核苷酸结合域NBD并不能形成有功能的 ABC转运蛋白，只有当它们再形成同源二聚体的时候，才能成为有功能的ABC转运蛋白。目前，与阿维菌素外排相关的基因并没有相关研究报道。对SAV933、SAV934进行详细的生物信息学比对，发现它们与崔西杆菌素外排蛋白BcrA有较高的同源性，并且与人类抗伊维菌素的ABC转运蛋白Pgp具有较高的二级结构同源性。这说明SAV933、SAV934 极有可能与阿维菌素或者其中间产物的转运相关。通过构建sav933、sav934的缺失突变株、定量分析胞内胞外阿维菌素，证实了 SaV933、sav934与阿维菌素的转运有关。本专利技术根据之前研究的空白和这一发现，设计了一个全新的提高阿维菌素产量的方法及质粒，将负责阿维菌素外排的基因构建在高拷贝载体上，构建的质粒可以在阿维链霉菌菌株中进行表达，最大限度地减少胞内反馈抑制，增加代谢产物的积累，有效提高阿维菌素有效组分Bla 的产量。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提供一种及其质粒，通过在抗生素生产菌株里超量表达相应的药物转本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：白林泉，邱竞帆，朱冬青，邓子新，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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