一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法技术

本发明专利技术属于细胞生物学技术领域，涉及体外传代细胞的培养技术，更具体涉及一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法。通过改变冻存细胞复苏的温度，缩短了复苏时间，提高了冻存细胞的复苏率，可达90-98％，保证了细胞生长质量，缩短了细胞复苏的增殖周期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学
，涉及体外传代细胞培养技术，更具体涉及。
技术介绍
在生物学技术飞速发展的当今，人们在细胞生物学及其相关学科的研究中，越来越多的运用细胞培养增殖技术，将有研究意义或有应用前景的细胞采用低温度进行长期保存数年，数十年甚至百年，一旦需要，可随时对所保存的细胞进行复苏，恢复其完整的形态结构与生物学特性，供生命科学研究实验。复苏率是指在长期冷冻保存状态下的细胞，经过复苏过程，恢复其活性与生物学特性的细胞数量占冻存细胞总数的百分比。影响细胞复苏率的因素有三部分降温冷冻过程、低温下保存过程及升温复苏过程。冻存细胞复苏后16-M小时，在普通光学显微镜下观察当复苏率小于40%时，见活细胞较少而且形态不规则，生长繁殖速度缓慢，甚至停止生长死亡，导致细胞保存失败； 当复苏率大于40%且小于70%时，显示部分成活细胞，细胞大小不均勻，生长繁殖速度慢， 培养5-7天才能生长成单层细胞；当复苏率大于80%时，显示成活细胞较多，细胞形态正常，生长繁殖速度快，培养2-3天就能生长成单层细胞。综上所述，升温复苏过程，是直接影响人工培养细胞增殖是否成功和顺利进行的一个关键技术。复苏率的高低是直接影响细胞生长质量与增殖周期的重要因素。所以复苏的方法对复苏率有重要和直接的影响作用。数十年来，大量国内外生物细胞学技术相关书籍，介绍常规的复苏方法如下操作1、从液氮中取出细胞冻存管，置37°C水浴，180-300秒融化，加入适配营养液，800 转/分钟离心5分钟，弃上清，加入适配生长液适量，静止37°C培养；2、16-M小时镜下观察复苏后的细胞状态，可见约60-70%的细胞贴壁生长，细胞形态边缘不光滑，有凹凸，大小不均勻，折光性差，培养液中有大量悬浮圆缩的无活力细胞；3、更换适配生长液，继续培养至48小时；4、镜下观察细胞未生长成单层，60-80%融合，继续培养至72-96小时，细胞完全融合，按比例传代培养；5、完成细胞复苏生长繁殖周期。以上广泛使用的复苏温度37°C，再者由于聚丙烯冻存管在实际中的大量广泛应用，造成传热性的差异，一般要180-300秒才能溶解完全，每分钟复温25 50°C，在排除其它影响因素的情况下，复苏率为40-80%。
技术实现思路
本专利技术目的是提供，该方法能保持细胞壁的完整，溶解速度更快，以达到使细胞形态结构与生物学特性恢复的更完整，复苏时间短，且复苏率高。为了达到上述专利技术目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的本专利技术提供，其特征在于步骤如下(1)从液氮中取出细胞冻存管，复苏温度46-67°C下水浴30_70秒，加入适配营养液，800转/分，离心5分，弃上清，得离心后的细胞；(2)离心后的细胞用适配营养液稀释，无菌取细胞，用台盼蓝染色，计数活细胞数和细胞总数，计算复苏率为95-98% ；(3)其余细胞加入适配生长液，静止37°C培养5-7小时，至90_95%的细胞贴壁；(4)更换细胞适配生长液继续培养48-72小时，至细胞完全融合生长成单层；按比例传代培养；完成细胞复苏生长繁殖周期。进一步，所述的复苏温度为55_60°C。在复苏过程中，冰晶在-50°C以上时进行得较快，因而缓慢解冻往往会由于重结晶而造成细胞死亡，迅速升温可使重结晶的晶体数量减至最少，也可使细胞处在高浓度溶质中的时间缩到最短，以减少细胞的“渗透压休克”，恢复细胞的正常生理功能。本专利技术与现有技术相比，复苏温度提高，复苏时间缩短，溶解速度更快，复苏速度分别可达100-250°C / min，复苏时间在30-70秒，6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约90-95%的细胞贴壁，细胞形态圆形，大小均勻，折光性好，有部分分支生长状态，培养液中有少量悬浮圆缩的无活力细胞；最终的细胞复苏率达90-98%，提高了传代细胞系冻存细胞的复苏率，保证了细胞生长质量，保持了细胞壁的完整，缩短了细胞复苏的增殖周期。通过下列实施例将更具体的说明本专利技术，但是所述实施例仅是为了说明本专利技术， 而不是以任何形式限制本专利技术的保护范围。具体实施例方式下述实施例中的适配营养液、适配生长液为申请人在GIBCO公司购买得到。实施例中所用的传代细胞系可为现有技术中的相应传代细胞系。实施例1 BHK21细胞的复苏方法1、从液氮中取出BHK21细胞冻存管，置67°C水浴复苏，32秒融化，加入适配营养液 (MEM)，800转/分离心5分钟；2、弃上清，用适配营养液(MEM)适当稀释，无菌取样用1 %台盼蓝染色，计算复苏率为97. 6% ；3、其余细胞加入适配生长液(含10% FBS的MEM)适量，静止37°C培养；4、6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约93-95%的细胞贴壁，细胞形态圆形，大小均勻，折光性好，有部分分支生长状态，培养液中有少量悬浮圆缩的无活力细胞；5、更换细胞适配生长液(含10% FBS的MEM)，继续培养至M小时镜下观察，细胞未生长成单层，85-90%融合，继续培养至36小时镜下观察，细胞完全融合生长成单层，在48小时细胞致密单层时按比例传代培养；6、完成细胞复苏生长繁殖周期。实施例2 IBRS-2细胞的复苏方法1、从液氮中取出IBRS-2细胞冻存管，置46°C水浴复苏，62秒融化，加入适配营养液(MEM)，800转/分离心5分钟；2、弃上清，用适配营养液(MEM)适当稀释，无菌取样用1 %台盼蓝染色，计算复苏率为95. 2% ；3、其余细胞加入适配生长液(含10% FBS的MEM)适量，静止37°C培养；4、6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约90-95%的细胞贴壁，细胞形态圆形，大小均勻，折光性好，培养液中有少量悬浮圆缩的无活力细胞；5、更换细胞适配生长液(含10% FBS的MEM)，继续培养至M小时镜下观察，细胞未生长成单层，80-85%融合，继续培养至36小时镜下观察，细胞完全融合生长成单层，在 48小时致密单层时按比例传代培养；6、完成细胞复苏生长繁殖周期。实施例3 PK15细胞的复苏方法1、从液氮中取出H(15细胞冻存管，置60°C水浴复苏，42秒融化，加入适配营养液 (DMEM)，800转/分离心5分钟；2、弃上清，用适配营养液(DMEM)适当稀释，无菌取样用1 %台盼蓝染色，计算复苏率在96. 7%之间；3、其余细胞加入适配生长液(含10% FBS的DMEM)适量，静止37°C培养；4、6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约95-97%的细胞贴壁，细胞形态圆形，大小均勻，折光性好，培养液中有极少量悬浮圆缩的无活力细胞；5、更换细胞适配生长液(含10% FBS的DMEM)，继续培养至M小时镜下观察，细胞100%融合，生长成单层，继续培养至36-48小时镜下观察，细胞致密单层，可按比例传代培养；6、完成细胞复苏生长繁殖周期。实施例4 Vero细胞的复苏方法1、从液氮中取出Vero细胞冻存管，置50°C水浴复苏，55秒融化，加入适配营养液 (DMEM)，800转/分离心5分钟；2、弃上清，用适配营养液(DMEM)适当稀释，无菌取样用1 %台盼蓝染色，计算复苏率在98. 1% ；3、其余细胞加入适配生长液(含10% FBS的DMEM)适量，静止37°C培养；4、6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约95-98%的细胞贴壁，细胞形态圆本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长辉，王敏，边程，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，福州大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：