本发明专利技术公开了一种基于Taqman探针的麦氏弧菌(Vibrio?metschnikovii)的荧光定量PCR快速检测方法，采用麦氏弧菌特异性引物和TaqMan探针，即可对水产品中麦氏弧菌进行检测与监控。其中上游引物Vmetschnikovii-1：5′-GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3′，下游引物Vmetschnikovii-2：5′-CCAAGATGGTCGATATCATC-3′，特异性TaqMan探针为：Vmetschnikovii-3：5′-CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3′。检测麦氏弧菌的方法包括细菌基因组DNA的提取、麦氏弧菌的荧光定量PCR检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高。另外，本发明专利技术与普通PCR技术相比，不需要凝胶电泳拍照观察，实现了检测流程一体化封闭检测，避免了PCR产物对实验室的污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于Taqman探针的水产品中麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii) 的荧光定量PCR快速检测方法。
技术介绍
麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)是革兰氏阴性菌，短小稍弯曲的弧状菌，无芽孢、无荚膜，有偏端单鞭毛一根，运动方式呈直线穿梭样，嗜盐菌，TCBS(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium)平板上生长，菌落呈黄色。麦氏弧菌是一种致病性弧菌，广泛存在于河流、海湾和下水道中。麦氏弧菌被国内外学者公认为11 种致病性弧菌之一，能够引起腹泻、创伤性感染和败血症。在饮用水中与腹泻病之间存在着密切的联系。现有麦氏弧菌的检测方法主要有传统常规分离鉴定法、普通PCR检测法、ATB细菌鉴定法等。基于Taqman探针的荧光定量PCR技术通过TaqMan探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性低，特异性好。目前尚未见用TaqMan探针快速检测水产品中麦氏弧菌的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测速度快、灵敏度高的快速检测水产品中麦氏弧菌的基于I1aqman探针的荧光定量PCR方法。研究表明麦氏弧菌携带的rpoB基因是RNA聚合酶β亚单位编码基因，具有较高的保守性。本专利技术根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)网站上公布的麦氏弧菌rpoB 基因全序列，以该特异基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，并且采用荧光定量 PCR快速技术检测麦氏弧菌，具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。可以作为水产品中麦氏弧菌的快速、简便、准确的检测方法。本专利技术的技术解决方案是一种快速检测麦氏弧菌的方法，其特征在于有如下步骤(1)首先提取待检样品TCBS平板上可疑菌落的基因组DNA。(2)荧光定量PCR反应液05 μ L体系)其中包括提取的基因组DNA，2y L ； 10 X PCR buffer，2. 5 μ L ；Mg2+, 2mmol/L ；Taq 酶 2U ；UNG酶IU ；dNTP 0. 2mmol/L ；麦氏弧菌特异性引物IOpmol ；TaqMan探针5pmol，最后加灭菌去离子水至25 μ L。(3)荧光定量PCR仪程序参数94 V预变性5min ；94 V变性30s，58 V退火30s，同时收集FAM荧光，72°C延伸30s，40个循环。其中麦氏弧菌特异性引物为CN 102534044 A上游引物Vmetschnikovii-I :5' -GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3‘下游引物Vmetschnikovii-2 :5' -CCAAGATGGTCGATATCATC-3‘特异性I^aqMan探针为Vmetschnikovii-3 5' -CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3‘荧光定量PCR反应结束后，麦氏弧菌能形成典型的S型扩增曲线，而且Ct值< 35。本专利技术提供了扩增麦氏弧菌的特异性引物Vmetschnikovii-l、Vmetschnikovii-2 和TaqMan探针Vmetschnikovii-3，从而提供了一种快速检测麦氏弧菌的方法，同现有检测技术相比具有如下优势快速性没有后处理，不用电泳、拍照，实时缩短了反应时间。灵敏度高光谱技术和计算机技术的联合使用，极大提高了检测的灵敏度。特异性强荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，二者缺一不可，故不存在非特异性扩增现象。有效解决PCR污染整个过程均在单管中进行，且勿需打开管盖，避免了 PCR产物对实验室的污染。具体实施方式首先无菌操作取25g待测水产品，充分剪碎，放入盛有225mL灭菌海水的灭菌容器中，进行10倍梯度稀释后，选择2 3个适当稀释度，各以0. ImL涂布到TCBS平板上，在 360C 士 1°C培养箱中，倒置培养Mh士池。挑取5个可疑菌落提取基因组DNA并稀释备用。 如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取进行基因组DNA提取并稀释备用。最后进行荧光定量PCR反应，每个荧光定量PCR反应总体积为25 μ L，其中包括提取的基因组 DNA, 2 μ L ； 10 X PCR buffer,2. 5μ L ；Mg2+, 2mmol/L ； Taq 酶 2U ； UNG 酶 IU ； dNTP 0. 2mmol/L ；麦氏弧菌特异性引物IOpmol ；TaqMan探针5pmol，最后加灭菌去离子水至 25 μ L0设置荧光定量PCR仪器的程序参数为94°C预变性5min ；94°C变性30s，58°C退火 30s，同时收集FAM荧光，72°C延伸30s，40个循环。其中麦氏弧菌特异性引物为上游引物Vmetschnikovii-I :5' -GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3‘下游引物Vmetschnikovii-2 :5' -CCAAGATGGTCGATATCATC-3‘特异性TaqMan探针为Vmetschnikovii-3 5' -CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3‘荧光定量PCR反应结束后，麦氏弧菌能形成典型的S型扩增曲线，而且Ct值< 35。核苷酸序列表<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心<120><160>3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1). . . (22)<400>1GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC 22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1). . . (20)<400>2CCAAGATGGTCGATATCATC 20<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1). . . (25)<400>3CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于Taqman探针的快速检测水产品中麦氏弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于首先提取TCBS平板上的可疑菌落的基因组DNA并稀释备用；再利用麦氏弧菌保守性强的基因组DNA序列设计特异性引物和探针；最后使用该引物和探针对待测水产品TCBS平板上可疑菌落的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增和荧光信号的检测。其中所述的麦氏弧菌特异性引物为上游引物 Vmetschnikovii-I 5' -GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3‘下游引物 Vmetschnikovii-2 5' -CCAAGATGGTCGATATCATC-3‘特异性TaqMan探针为Vmetschnikovii-3 5' -CGTAGGTCGTATGAAGTTCAAT...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾俊涛，吴振兴，李正义，祝素珍，姜英辉，马云，张健，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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