本发明专利技术提供了一种高度纯化和热稳定的交联非聚合四聚体血红蛋白，其适合用于哺乳动物而不导致肾损伤和血管收缩。进行高温和短时间(HTST)热加工步骤以有效地去除不合乎需要的二聚体形式的血红蛋白、未交联的四聚体血红蛋白和血浆蛋白杂质。在热处理后和任选地在热处理前添加N-乙酰半胱氨酸保持了低水平的高铁血红蛋白。该热稳定的交联四聚体血红蛋白可以改善和延长正常和低氧组织中的氧合。在另一方面，该产品用于治疗多种类型的癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。本发明专利技术的四聚体血红蛋白还可以用来预防手术切除肿瘤后的肿瘤转移和复发。此外，本发明专利技术的四聚体血红蛋白可以在化疗和放疗之前施用于患者。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法和由该方法制备的组合物。本专利技术还涉及所述热稳定的包含氧载体的药物组合物在人和其他动物的癌症治疗、缺氧病症(oxygen-d印rivation disorder)以及器官保存中的用途。
技术介绍
血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统和组织之间的气体交换具有重要作用。其负责经由血液循环将氧从呼吸系统运送至体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从体细胞运离至呼吸系统，在呼吸系统二氧化碳被呼出。由于血红蛋白具有此氧运输特性，因此如果其在离体状态下可以被稳定并且可以在体内使用，则其可以被用作有效的供氧器。天然存在的血红蛋白是四聚体，当其存在于红细胞内时通常是稳定的。然而，当天然存在的血红蛋白移出红细胞中时，其在血浆中变得不稳定，并且分裂成两个α-β 二聚体。这些二聚体的每一个的分子量为约32kDa。这些二聚体当通过肾脏过滤和分泌时可能导致实质性的肾损伤。四聚体键的断裂也负面地影响了功能性血红蛋白在循环系统中的持久性。为了解决所述问题，近年来在血红蛋白加工方面的发展已经引入了多种交联技术来形成四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键，从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而，本专利技术人确定，聚合血红蛋白在血液循环中更容易转变成为高铁血红蛋白。高铁血红蛋白不能结合氧因此不能氧合组织。因此，现有技术教导的导致形成聚合血红蛋白的交联作用是有问题的。在本领域中存在着对允许分子内交联从而形成稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术的需求。现有技术为稳定血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括产生的四聚体血红蛋白中包含无法接受的高百分比的二聚体单位；二聚体的存在使得血红蛋白组合物不能令人满意地施用于哺乳动物。血红蛋白的二聚体形式可以导致哺乳动物机体的严重肾损伤； 此肾损伤可以严重到足以导致死亡的程度。因此，本领域中存在着对在终产物中形成含有检测不到的二聚体形式的稳定的四聚体血红蛋白的需求。现有技术血红蛋白产品的另一个问题是在施用后血压突然升高。过去，已经从较早一代的基于血红蛋白的氧载体记录到血管收缩事件。例如，如由KatZ等，2010公开的那样，Hemopure 产品(Biopure Co.，USA)导致较高的平均动脉压(1 士9mmHg)或比基线 (96士 IOmmHg)高30%。过去解决此问题的尝试依赖于巯基试剂与血红蛋白巯基反应，据说能防止内皮衍生舒张因子与巯基的结合。然而，巯基处理的使用增加了加工步骤，导致成本和杂质的增加，这些杂质以后必须从血红蛋白组合物中去除。因此，在本领域中存在着对当施用于哺乳动物时不导致血管收缩和高血压的血红蛋白的制备方法的需求。现有技术为形成稳定的血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括蛋白杂质诸如免疫球蛋白G的存在可以导致哺乳动物中的变态反应效应。因此，本领域中存在着对可以产生稳定的四聚体血红蛋白同时不含蛋白杂质的工艺的需求。除了上述问题以外，在本领域中存在着对稳定的四聚体血红蛋白的需求，所述四聚体血红蛋白不含二聚体、不含磷脂并且能够以工业规模生产。
技术实现思路
本专利技术提供了一种加工非聚合的、热稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白的方法， 所述交联四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不会导致严重的肾损伤、血管不利影响和严重的不良事件包括死亡。本专利技术去除了二聚体形式的血红蛋白、未交联的四聚体血红蛋白、磷脂和蛋白杂质。另外，本专利技术使用(1)快速细胞裂解设备，所述设备用于精确的和可控的低渗裂解，⑵流通柱色谱(flowthrough column chromatography), (3)短时间高温 (HTST)设备，所述设备在纯化过程中用于热加工血红蛋白溶液以去除不需要的不稳定的血红蛋白二聚体并去除蛋白杂质，例如免疫球蛋白-G，使得可以避免肾损伤、血管不利影响和其他毒性反应，和(4)气密输液袋包装以避免氧侵入至产品中。该方法包括哺乳动物全血的起始材料，所述全血至少包括红细胞和血浆。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离，接着过滤从而获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质。在快速细胞裂解设备中以50-1000升/小时的流速通过可控的低渗裂解来破裂所述洗涤过的红细胞足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间。进行过滤从而从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物。从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液。使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成从第一血红蛋白溶液中去除分子量比四聚体血红蛋白高的杂质并且进一步去除任何病毒和残留的废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液。对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱(Flowthrough column chromatography)以去除蛋白杂质、二聚体血红蛋白和磷脂以形成无磷脂的血红蛋白溶液。 使用滤器对所述无磷脂的血红蛋白溶液进行第二超滤过程，所述滤器被配置成去除杂质， 产生浓缩纯化的无磷脂的血红蛋白溶液。通过富马酸二 _3，5-二溴水杨酸酯(bis-3, 5-dibromosalicyl fumarate)至少交联纯化的血红蛋白的α-α亚单位从而形成热稳定的交联血红蛋白而不形成聚合血红蛋白，使得得到的非聚合的交联四聚体血红蛋白的分子量为60_70kDa。本文中使用的表达“非聚合的”是指未与其他血红蛋白分子或任何其他非血红蛋白分子诸如PEG通过分子间交联的四聚体血红蛋白。用合适的生理缓冲液诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乳酸盐林格溶液、乙酸盐林格溶液或Tris缓冲液交换交联四聚体血红蛋白。使用切向流过滤去除任何残留的化学物质。在此步骤后，将交联血红蛋白热处理以去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何不稳定的血红蛋白，例如，二聚体形式的血红蛋白，和任何其他蛋白杂质。在热处理之前，任选地向所述交联四聚体血红蛋白加入约0. 2%浓度的N-乙酰半胱氨酸从而防止形成高铁血红蛋白。热处理和冷却后立即加入约0. 2-0. 4%浓度的N-乙酰半胱氨酸以进一步防止高铁血红蛋白的形成。热处理优选地是在约70°C -95°C下进行30秒至3小时的短时间高温处理，然后冷却至25° C。之后将在热处理期间形成的任何沉淀物通过离心或过滤设备去除以形成澄清溶液。然后将所述无二聚体、无磷脂、无蛋白杂质、热稳定的非聚合的交联四聚体血红蛋白加入至药学可接受的载体。此后，将所述热稳定的交联四聚体血红蛋白配制并包装在定制的和气密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇(PE、EVA、EV0H)输液袋中。该包装阻止氧污染，氧污染会导致形成无活性的高铁血红蛋白。通过上述方法制备的热稳定的交联四聚体血红蛋白用于治疗多种癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。破坏癌细胞的机制是改善了低氧条件下肿瘤的氧合，从而提高了对放射线和化疗剂的敏感性。该热稳定的交联四聚体血红蛋白也可用于在移植期间保存器官组织或用于在体内缺少供氧的情况下(诸如在缺氧心脏中) 保存心脏。附图说明图1描绘了不同血红蛋白的氨基酸序列比对；图2描绘了本专利技术的方法概述的流程图3示意性描绘了本专利技术的方法中使用的快速细胞裂解设备(instant cytolysis apparatus)；图4描绘了对于(a)未经热处理的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄炳镠，郭瑞仪，
申请(专利权)人：黄炳镠，郭瑞仪，
类型：发明
国别省市：
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