本发明专利技术提供了一种高温稳定的和高度纯化的交联的(任选地≥70％β-β交联)的四聚体血红蛋白，其具有高效的氧输送功能，所述四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不导致肾损伤和血管收缩。将二聚体形式的血红蛋白变性并对来自全血的红细胞进行纯化。在快速细胞裂解设备中进行可控低渗裂解以防止白细胞的裂解。在裂解液中没有检测到来自白细胞的核酸和磷脂杂质。在氧合环境中通过巯基试剂封闭活性巯基。流通柱色谱去除不同的血浆蛋白杂质。将N-乙酰半胱氨酸加入至交联的四聚体血红蛋白以保持低水平的高铁血红蛋白。稳定的血红蛋白保存在带有铝外包装的输液袋中以防止氧侵入形成无活性的高铁血红蛋白。该产品用于组织氧合和癌症治疗。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备高温稳定的含氧载体的药物组合物的方法和由该方法制备的组合物。本专利技术还涉及所述高温稳定的含氧载体的药物组合物在人和其他动物的癌症治疗、缺氧病症(oxygen-d印rivation disorder)以及器官保存中的用途。
技术介绍
血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统和组织之间的气体交换具有重要作用。其负责经由血液循环将氧从呼吸系统运送至体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从体细胞运离至呼吸系统，在呼吸系统二氧化碳被呼出。由于血红蛋白具有此氧运输特性，因此如果其在离体状态下可以被稳定并且可以在体内使用，则其可以被用作有效的供氧器。天然存在的血红蛋白是四聚体，当其存在于红细胞内时通常是稳定的。然而，当天然存在的血红蛋白移出红细胞中时，其在血浆中变得不稳定，并且分裂成两个α-β 二聚体。这些二聚体的每一个的分子量为约32kDa。这些二聚体当通过肾脏过滤和分泌时可能导致实质性的肾损伤。四聚体键的断裂也负面地影响了在循环系统中功能性血红蛋白存在的持久性。为了防止四聚体的分解，近年来在血红蛋白加工方面的发展已经引入了多种交联技术来形成四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键，从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而，本专利技术人确定， 聚合血红蛋白在血液循环中更容易转变成为高铁血红蛋白。高铁血红蛋白不能结合氧因此不能氧合组织。因此，现有技术教导的导致形成聚合血红蛋白的交联作用是有问题的。在本领域中存在着对允许分子内交联从而形成稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术的需求。现有技术为稳定血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括产生的四聚体血红蛋白中包含无法接受的高百分比的二聚体单位；二聚体的存在使得血红蛋白组合物不能令人满意地施用于哺乳动物。血红蛋白的二聚体形式可以导致哺乳动物身体的严重肾损伤； 此肾损伤可以严重到足以导致死亡的程度。因此，本领域中存在着对在终产物中形成含有少量不需要的二聚体形式的稳定的四聚体血红蛋白的需求。现有技术为形成稳定的血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括蛋白杂质诸如免疫球蛋白G的存在可以导致哺乳动物中的变态反应效应。因此，本领域中存在着对可以产生稳定的不含蛋白杂质的四聚体血红蛋白的工艺的需求。现有技术血红蛋白制剂的其他问题包括在哺乳动物中输液后产生血管收缩。已经表明此血管收缩是由于内皮衍生舒张因子与血红蛋白分子的活性巯基结合所引起的。因此，本领域中存在着对形成稳定的四聚体血红蛋白的需求，所述四聚体血红蛋白在输液后不会导致血管收缩。除了上述问题以外，在本领域中存在着对稳定化的四聚体血红蛋白的需求，而所述四聚体血红蛋白须不含磷脂并且能够以工业规模生产。
技术实现思路
本专利技术提供了一种制备高温稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白的方法，所述交联四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不会导致严重的肾损伤、血管不利影响或其他严重的不良反应(包括死亡)。本专利技术还包括高温稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白和所述血红蛋白用于氧合体内和离体组织的用途。该方法包括哺乳动物全血的起始材料，所述全血至少包括红细胞和血浆。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离，紧接着过滤从而获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质。在快速细胞裂解设备中以50-1000升/小时的流速通过可控的低渗裂解来裂解所述洗涤过的红细胞，持续足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间。进行过滤从而从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物。从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液。使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成从第一血红蛋白溶液中去除分子量比四聚体血红蛋白高的杂质并且进一步去除任何病毒和残留的废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液。对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱(Flowthrough column chromatography)以去除蛋白杂质、二聚体血红蛋白和磷脂以形成无磷脂和低含量的二聚体的血红蛋白溶液。使用配置成去除杂质的滤器对所述无磷脂和低二聚体的血红蛋白溶液进行第二超滤过程，产生浓缩纯化的无磷脂和低二聚体的血红蛋白溶液。在充分氧合的环境中通过巯基试剂封闭所述浓缩纯化的无磷脂和低二聚体血红蛋白溶液中血红蛋白分子的巯基。得到的每个血红蛋白分子具有至少一个包含巯基保护基团的半胱氨酸部分，使得所述血红蛋白分子不能在所述半胱氨酸位点处结合内皮衍生舒张因子。通过富马酸二_3，5-二溴水杨酸酯(bis-3，5-dibromosalicy fumarate)交联巯基保护的血红蛋白的至少α-α和/或β-β亚单位从而形成高温稳定的交联四聚体血红蛋白而不形成聚合血红蛋白使得得到的交联四聚体血红蛋白的分子量为60_70kDa。用合适的生理缓冲液交换所述交联四聚体血红蛋白。通过使用切向流超滤去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何残留的化学物质。向所述交联四聚体血红蛋白加入0. 2-0. 4% 的浓度的N-乙酰半胱氨酸从而将高铁血红蛋白的水平保持在5%以下。然后将所述无磷脂、低二聚体、巯基保护的高温稳定的交联四聚体血红蛋白加入至药学可接受的载体；所述药学可接受的载体可以是生理缓冲液或水。紧接着此步骤，得到的血红蛋白任选地包装在气密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、 乙烯-乙烯醇(PE，EVA，EV0H)输液包装中。该包装阻止氧污染，氧污染会导致形成无活性的高铁血红蛋白。通过上述方法制备的高温稳定的交联血红蛋白用于治疗多种癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和食管癌。破坏癌细胞的机制是改善肿瘤细胞中的氧合，从而提高对放射线和化疗剂的敏感性。该高温稳定的交联四聚体血红蛋白也用于在移植期间保存器官组织或用于在体内缺少供氧的情况下(诸如在缺氧心脏中)保存心脏。附图说明图1描绘了不同物种血红蛋白的氨基酸序列比对，包括牛，人，狗，猪和马。图2描绘了本专利技术的方法的流程图。图3示意性描绘了本专利技术的方法中使用的快速细胞裂解设备(instant cytolysis apparatus)0图4是显示在氧合和缺氧环境中血红蛋白与巯基试剂的反应的图。图5描绘了对于交联四聚体血红蛋白的高效液相色谱分析。图6描绘了对交联四聚体血红蛋白的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。图7显示了对(a)纯化的血红蛋白溶液和(b)交联四聚体血红蛋白的圆二色性 (CD)光谱分析。图8显示了交联四聚体血红蛋白的体外化学增敏作用。图9描绘了使用本专利技术的交联四聚体血红蛋白改善了正常组织中的氧合。图10显示了使用本专利技术的交联四聚体血红蛋白改善了极度低氧的肿瘤区域中的氧合。图11显示了在用本专利技术的稳定化的交联四聚体血红蛋白治疗后，严重失血性休克的大鼠模型中的平均动脉压变化。图12是流通柱色谱的洗脱图；血红蛋白溶液处于流过级分中。图13示意性描绘了用于工业规模生产的具有超滤作用的流通CM柱色谱系统。图14是氧合环境中的巯基反应和缺氧环境中的反应之间的比较。图15证明与现有技术血红蛋白相比本专利技术的交联四聚体血红蛋白的热稳定性更尚ο图16是用于本专利技术的交联四聚体血红蛋白的输液袋的示意图。图17是用来测试体外高铁血红蛋白形成的设备的示意图。图18描绘了在图17的设备中聚合血红蛋白和本专利技术的血红蛋白形成高铁血红蛋白的速率。具体实施例本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄炳镠，郭瑞仪，
申请(专利权)人：黄炳镠，郭瑞仪，
类型：发明
国别省市：
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