本发明专利技术涉及一种猪繁殖与呼吸综合征毒病抗体胶体金快速诊断试纸条，其特征在于：试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的PRRSVNsp9蛋白；硝酸纤维素膜上分别包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)构成的检测线T线和PRRSVNsp9单克隆抗体2D6构成的质控线C线。其利用免疫学抗原抗体能特异性结合原理，胶体金标记抗原与相应抗体结合，这种抗原抗体结合物再与葡萄球菌蛋白A(SPA)结合，形成抗原-抗体-SPA结合物在硝酸纤维素膜(NC膜)上出现颜色反应，可以肉眼观察；具有简单、快速、敏感和特异性好等特点。并且价格低廉，适用于基层或临床检测猪繁殖与呼吸综合征毒病抗体。具有特异性强、灵敏度高、操作简单和诊断快速的显著优点，可用于猪繁殖与呼吸综合征毒病的快速诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金快速诊断试纸条，属于一种新的动物诊断试剂，主要用于诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的动物；应用于畜牧兽医学领域。
技术介绍
ItMMi^Bf ^^-π Π: (Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS) 由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起，主要特征为怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍以及仔猪与育肥猪的呼吸道疾病。PRRS是上世纪80年代后期暴发的一种新的传染性疾病，于1987年首发于北美地区，在随后的几年内，便迅速地在欧、美大陆的许多国家流行，随后又蔓延至亚洲的一些国家，成世界范围内的大流行，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。我国自1995年底暴发此病，并迅速传播至全国各地，成为我国规模化养猪场引发繁殖障碍的主要疫病之一。近年来PRRS呈持续性感染，并导致继发性感染增加，严重威胁了养猪业的发展。目前猪繁殖与呼吸综合征病毒病检测主要采用的技术方法有ELISA、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术、免疫荧光技术、荧光RT-PCR、环介导逆转录等温检测(RT-LAMP)、基因芯片以及病毒的分离鉴定等。比较快速准确的技术是ELISA和荧光 RT-PCR，但这2种技术都需要特殊的仪器设备，并且检测时间都在2小时以上，检测成本昂贵，不便于适时和快速诊断。这些限制了猪繁殖与呼吸综合征病毒病的预防控制，因此研制出一种特异性强、灵敏度高、简单易行的诊断方法迫在眉睫。
技术实现思路
专利技术涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法，该方法是利用基因工程表达猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白，利用免疫学抗原抗体能特异性结合原理，胶体金标记抗原与抗体结合，快速检测猪血液或血清中与病毒复制相关抗体；该测试纸条可广泛用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测；与其他病毒无交叉反应，与ELISA、中和试验两种方法检测的符合率分别为95. 3%和93. 12%。与ELISA 相比，重组抗原免疫胶体金具有明显的优势安全性好，无需培养病毒本身，避免了因操作病毒造成的病毒扩散；可以大批量制备，工艺简单，生产成本低廉；抗原成分稳定均一， 操作简便省力，不用仪器，检测结果特异性高，重复性好。整个实验仅需15分钟。操作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。本专利技术的技术方案是这样实现的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金快速诊断试纸条，其特征在于试纸条由样品垫(1)、结合垫O)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4) 依次粘附在不吸水的支撑薄片( 上；其中结合垫( 上包被有胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9重组蛋白；硝酸纤维素膜(3)上分别包被SPA构成的检测线T线(6)和抗Nsp9蛋白单克隆抗体IgG构成的质控线C线(7)。所述的结合垫(2)上包被的胶体金标记的猪繁殖与呼吸病毒Nsp9蛋白的制备方法如下(1)首先利用基因工程菌原核表达Nsp9蛋白，所制备抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白，且为病毒特有蛋白，这就决定了试纸条的特异性；(2)将纯化的PRRSV Nsp9蛋白制备金标抗原，用0. IM碳酸钾调胶体金的PH值至8. 2， 按IOOug /毫升胶体金加入Nsp9蛋白，磁力搅拌器混勻30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置1小时。40C 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4°C备用。(3)将结合垫浸泡于封闭液即2% BSA、0. 5%吐温-20、2. 5%蔗糖、0. 05%叠氮钠、 0. OlM PBS中30分钟，37°C烘干；然后将制备好的金标抗原均勻喷涂于结合垫上，每毫升铺 20平方厘米，冻干、保存。所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)构成的检测线T线(6) 是选用一种能够与IgG分子Fc片段特异性结合的蛋白(SPA)喷涂于检测线上，用包被缓冲液将SPA稀释到50ug/ml，调整机器划线为T线，即为检测线靠近结合垫，距结合垫一端约 5mm ο所述的PRRSV Nsp9单抗2D6 (IgG1)构成的质控线C线(7)是以I3RRSV Nsp9蛋白作为抗原，免疫小鼠，利用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9单克隆抗体，得到细胞株2D6，并获得纯化的抗体，用包被缓冲液将单抗稀释到50-100ug/ml，调整机器划线为C线，即为对照线靠近吸收垫，距吸收垫端约3mm;两线距离5-8mm，在硝酸纤维素膜NC膜上的质控线上， 可与金标抗原结合，以此检验试纸条的有效性。所述的试纸条的检测方法是样品血清中抗PRRSV Nsp9抗体先和胶体金标记的 Nsp9抗原结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有PRRSV抗体， 到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素膜上的SPA，就会形成金标抗原-抗体-SPA复合物，从而凝集在检测线上，形成特异性的红色沉淀线，没有和抗体结合的金标抗原则会直接通过检测线，富集在质控线上形成红色沉淀线，即判为阳性结果，若样品中无PRRSV Nsp9抗体， 反应复合物到达检测线时遇到SPA就不会形成复合物，反应复合物通过检测线，富集在质控线上，形成红色沉淀，即判为阴性结果。本专利技术的优点是1、具有生物安全性，其所使用的金标抗原为基因工程菌表达的重组病毒蛋白，不含猪繁殖与呼吸综合征病毒，因此不存在散毒的危险。2、特异性强，胶体金试纸条金标抗原能够特异性的与PRRSV Nsp9抗体结合，检测线上的SPA能够与IgG分子Fc片段特异性结合，为捕获抗原，二者提高了检测的敏感性和特异性。3、其可快速检测即10-15分钟；不需特殊仪器设备，可用于现场操作；操作简单， 一步完成，无需专业人员操作；检测成本低；储存方便。附图说明图1为本专利技术所涉及的PRRSV重组蛋白。图2为本专利技术试纸条的结构模式图。图3为本专利技术试纸条结果判定示意图。具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1表达猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白制备l、Nsp9基因7817 - 8657nt的扩增参照PRRSV BJ-4序列，设计并合成1对引物，扩增Nsp9基因的部分片段(7817 - 8657nt)。上游引物下划线为HindIII序列，下游引物下划线为BioI序列；PCR反应条件为，94°C 热启动5分钟，94°C变性60秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，最后72°C延伸10分钟， 扩增产物为840bp，经琼脂糖电泳；1. 2Nsp9基因片段在pMD-18T中的克隆将扩增产物利用胶回收试剂盒回收，利用T-A原理，与PMD-18T载体连接，转化DH5ci感受态大肠杆菌，涂布于氨苄青霉素的LB片板，12小时后挑取典型白色单菌落培养，提质粒DNA。通过HindIII和XhoI双酶切鉴定，命名为pMD-Nsp9 ;1. 3Nsp9基因在pET_28a中的克隆原核表达载体pET-28a是上游带有His标签的高效表达载体，用HindIII和BioI双酶切重组质粒pMD-Nsp9,插入片段840bp,回收其中840bp,用HindIII和XhoI本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁壮，黄志强，张晓东，郭育培，杨建新，母连志，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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