本发明专利技术涉及能够分泌α-半乳糖苷酶到培养基中的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株，还涉及使用所述菌株获得α-半乳糖苷酶的方法和通过在富含半乳糖的培养基培养所述的菌株生产生物质和生物乙醇的方法。另一方面，本发明专利技术提供表达重组蛋白的方法，该方法使用富含半乳糖的组合物作为培养基用于生产所述蛋白的微生物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够生产α-半乳糖苷酶的酿酒酵母(S. cerevisiae)菌株。为了其更好地分泌，在α-半乳糖苷酶的基因上融合了信号序列。所述的菌株用于在富含棉子糖、 蜜二糖和/或水苏四糖的培养基中生产α “半乳糖苷酶，生物质和乙醇的方法中，并且如果菌株含有表达具有治疗功能蛋白的二级构建体，则可以用于生产所述治疗蛋白。
技术介绍
α -半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 22)催化半乳糖残基水解，该残基与半乳糖低聚糖和半乳糖甘露糖聚合物(带有半乳糖支链的甘露糖聚合物)通过α (1,6)糖苷键结合；也水解在豆子，大豆及其他豆类中存在的诸如水苏四糖，棉子糖和蜜二糖的低聚糖。这些酶广泛地分布在动物，植物和微生物中。但是大多数单胃哺乳动物包括人类，缺乏胰腺α-半乳糖苷酶以至于这种类型的低聚糖不能在消化系统中消化，并通过肠道微生物群落发酵产生气体引起肠胃气胀和其他形式肠胃紊乱，可导致问题的严重性因个体敏感度而不同。大豆及其衍生产品具有特别的重要性，因为它们是许多人饮食的重要组成部分，基于它们是好的蛋白质的来源，在某些情况下可以用作乳制品的替代品，例如对于不能耐受乳糖的人群而言。有一些由来自不同来源(乳酸球菌(Lactococus)，曲霉菌 (Aspergillusniger)，酵母(Saccharomyces)等)的α -半乳糖苷酶浓缩物构成的食品补充物，例如，诸如Promefarm(Sinaire)生产的片剂用于治疗这些紊乱。这些大豆制品以及其他制备的用于人和动物消耗的具有高含量的非消化性低聚糖如棉子糖，水苏四糖的产品用α-半乳糖苷酶的预处理，是很好的替代方法以避免这些肠胃问题。其进一步的贡献是增强其营养价值；这一点通常在动物营养中是非常重要的，因为对饲料能量的利用在增加。在人体内，α -半乳糖苷酶是一种溶酶体的外切糖苷酶，在糖脂和糖蛋白的α -半乳糖基型末端残基上发生作用。这个基因的变异导致降解的缺乏，引起Fabry氏病(X-连锁溶酶体贮积病)。这种疾病的发病率为1/40，000。今天的治疗手段有，例如由美国健赞公司(Genzyme Corp.)开发的(Fabrazyme，β -半乳糖苷酶A静脉滴注剂)，其基于酶替代性技术通过将人类α-半乳糖苷酶在中国仓鼠卵巢细胞表达用于治疗该疾病。更有效降低成本的选择是将哺乳动物细胞用于异源蛋白的生产；人类α-半乳糖苷酶重组表达在酵母上的应用已经被研究。另外，在红细胞的表面的糖蛋白杯型结构在许多其他功能中，决定了每一个个体的血型。0型血可以输给任何个体，因此它是最被需要的。0型血可以被通过使用能够加工 α (1-3)型半乳糖键的α-半乳糖苷酶的B型血冒充。α-半乳糖苷酶也被用于在工业水平上生产焦糖和糖类以去除棉子糖的存在，这将抑制焦糖的适当结晶，并因此改进了该生产。此外，糖蜜，该工业中的废产品具有很高的棉子糖和水苏四糖含量，意味着由于其具有很高的生物降解能力(BOD)不能被直接抛弃。 这种生产该糖的酶或者有机体被用于降解这些糖并将这种降解与其他功能结合，例如生产乙醇或者生物质。进一步，糖蜜被广泛地作为基质，用于每年大约生产430000吨(干重)制造面包用的酿酒酵母(S. cerevisiae)。这种制备面包用的酵母菌株缺乏α -半乳糖苷酶， 并且酿酒酵母菌株已经被开发用于制备面包，该类菌株是带有编码α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母变型葡萄汁酵母菌株(S. cerevisiae Var. uvarum)，目的在于提高这种生物质的生产(利尔耶施特勒姆_索米宁等；应用环境微生物学.1988年1月；第54卷第1期，第 245-249 M) ( Liljestrom-Suominen et al. ；Appl Environ Microbiol. 1988 Jan ；54(1) 245-249)。就酵母来说，已经有文献记载了，α -半乳糖苷酶释放在半乳糖的末端的非还原残基，该残基是位于该底物的末端的位置而不是内部的残基0。除了水解活性外，α-半乳糖苷酶具有在高浓度单糖存在下，通过转糖基作用和反向水解合成低聚糖的能力0。酿酒酵母是研究最多的α-半乳糖苷酶来源之一以及其在生物技术上的应用是广泛的()。考虑到这种酶的重要性和广泛的生物技术应用，有关于从细菌(bacteria) 生产α -半乳糖苷酶的资料，所述细菌例如有嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophi lus)(美国专利号3846239)，嗜热菌种(Thermus sp.)菌株 T2 (西班牙专利号2172380)，浅灰白链霉菌(Sti^ptomyces griseoloalbus) (Anisha et al. ；Appl Biochem Biotechnol. 2008 Sept 4) (Anisha 等；生物化学生物技术应用.2008 年 9 月 4 日)，然而考虑到这种酶具有的很多应用与涉及动物或人类食品的原料的加工或制备有关，必须是，这些将要被使用的微生物是GRAS (GeneralIy Recognized As Safe,公认为安全的)，酿酒酵母就是例子。也有关于从真菌生产α-半乳糖苷酶的资料，所述真菌是链抱霉属(Neurospora)禾口根霉属(Rhizopus) (fforthington and Beuchat, J Agric Food Chem. 1974 ；22 (6) 1063-6)(沃辛顿和伯沙，食品农业化学杂志.1974年第22卷第6期第 1063-6 页)，米曲霉菌(Aspergillus oryzae),臭曲霉菌(A. foetidus) (Liu et al., Lett Appl Microbiol. 2007 Aug ；45 (2) :206_12)(刘等，生物工程与应用微生物.2007 年 8月第45卷第2期第206-12页)，无花果曲霉菌种(A. ficuum) (Zapater et al.，Prep Biochem. 1990 ；20 (3-4) :263_96)(萨帕特尔等，制备生物化学· 1990年第20卷第3-4期第263-96页)和黑曲霉种(A.niger)(美国专利号6197566和5919690)，其中，然而真菌生产的主要的缺点之一是产生不想要的副产品。就在黑曲霉中生产α-半乳糖苷酶来说， 大量的草酸产生。同样地，有关于生产非人类的α-半乳糖苷酶的资料，例如从融合不同信号序列的瓜尔豆植物存在的(Cyamopsis tetragonoloba) (Harmsen, Μ. et al.，Gene. 1993 Mar 30 ； 125 (2) 115-23)(哈姆森，Μ·等，基因.1993 年 3 月 30 日第 125 卷第 2 期第 115-23 页)。关于在酵母中生产，美国专利4431737描述了一种变异的生产α _半乳糖苷酶的酿酒酵母菌株，该菌株通过紫外线照射的方法突变获得。通过用紫外线诱导处理突变得到的菌株的缺点是，由于嘧啶引物的构型导致了双螺旋结构的局部扭曲，干扰了正常互补碱基配对，从而使这种处理根本性改变了 DNA ；这反过来干扰复制和转录过程以及接下来的生长和呼吸。因此，除了能够具有其他不想要的突变外，因此突变的菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·贝塞拉费尔南德斯，M·E·塞尔当维拉纽瓦，R·费尔南德斯莱罗，M·I·冈萨雷斯斯索，A·佩雷拉罗德里格兹，
申请(专利权)人：M·贝塞拉费尔南德斯，M·E·塞尔当维拉纽瓦，R·费尔南德斯莱罗，M·I·冈萨雷斯斯索，A·佩雷拉罗德里格兹，
类型：发明
国别省市：
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