本发明专利技术公布了一种产2,3-丁二酮工程菌及其构建方法和应用，属于发酵工程领域。本发明专利技术提供的工程菌株是通过基因重组的方法，将编码乙酰乳酸合成酶的基因alsS游离表达于光滑球拟酵母CCTCCM?202019中。所述菌株在丙酮酸发酵生产过程中，可积累0.63g/L的2,3-丁二酮，这为微生物发酵法生产2,3-丁二酮提供了一条新的思路，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产2，3-丁二酮工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本专利技术还涉及一种产2，3- 丁二酮工程菌的应用，特别是发酵生产2，3- 丁二酮，属于发酵工程领域。
技术介绍
2，3- 丁二酮俗称双乙酰，经稀释后呈强烈奶油香味，我国GB2760-86规定其为允许使用的食用香料，主要用于配制奶油、干酪发酵风味和咖啡等型香精。与化学合成法和天然物提取法相比，微生物发酵法生产香料具有产品风味醇厚、柔和、安全性高，生产成本低廉、环境友好等优势。能够代谢产生2，3-丁二酮的微生物较多，典型的菌株有乳品工业中应用广泛的乳杆菌、明串珠菌及乳酸乳球菌属双乙酰亚种，但产量均不高，只能赋予乳制品奶油香味，无法大规模的提纯、制备单体香料。微生物中，2，3_ 丁二酮代谢于支链氨基酸合成途径中间产物乙酰乳酸的非酶氧化脱羧。因此，其前体物质乙酰乳酸的积累是菌体过量合成2，3-丁二酮的关键，可通过弱化或阻断丙酮酸流入乳酸、乙酸、乙醇及TCA循环等代谢途径，强化丙酮酸至乙酰乳酸途径的代谢通量的方法来促进乙酰乳酸的积累，达到微生物高产2，3- 丁二酮的目的。丙酮酸作为合成2，3_ 丁二酮的关键前体物质，其在胞内高效合成与积累是获得高产量2，3-丁二酮的前提条件。作为丙酮酸的生产菌株光滑球拟酵母CCTCCM 202019，通过高渗环境的筛选、NTG等诱变育种、维生素营养缺陷型选育以及基于代谢网络提高糖质底物消耗速率和解除丙酮酸底物抑制等策略，实现了丙酮酸高产量、高产率和高积累相统一的目标。因此，光滑球拟酵母CCTCCM 202019可作为2，3-丁二酮的潜在生产菌株。
技术实现思路
针对上述现有菌株中，2，3_ 丁二酮产量低、提取复杂，难以大规模生产的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种产2，3- 丁二酮工程菌。本专利技术是基于2，3- 丁二酮的高产策略及光滑球拟酵母能够大量积累丙酮酸的优势，将编码乙酰乳酸合成酶的基因在光滑球拟酵母中表达，提高胞内乙酰乳酸合成酶酶活性，促进丙酮酸向乙酰乳酸支路的代谢，实现2，3-丁二酮的积累。本专利技术所要解决的一个技术问题是提供一种上述产2，3- 丁二酮工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为1)利用PCR从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中扩增克隆乙酰乳酸合成酶基因(alsS,1713bp)2)将扩增得到的alsS与酵母表达载体ρ (212酶切、纯化连接，连接产物转化到 Ε. coli JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子3)提取质粒、酶切验证，得到重组表达载体pra212-alsS4)将构建好的质粒采用电转化法导入受体菌当中，涂布tea缺陷平板5)验证所述工程菌步骤4)中所述受体菌为光滑球拟酵母CCTCC M202019的尿嘧啶缺陷型 Torulopsisglabrata Δura30本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种所述产2，3- 丁二酮工程菌在发酵生产2，3_ 丁二酮中的应用。发酵生产丙酸的工艺为30°C、200r/min基本培养基摇瓶培养所述工程菌至对数中期，以10%接种量接种入摇瓶发酵培养基，初始pH 5.5，30°c、200r/min发酵7 收集上清液，分析2，3-丁二酮等含量。附图说明图1表达质粒pYX212_alsS物理图谱及其酶切验证、Torulopsis glabrata FMME 055转化子的PCR验证A :pYX212-alsS 物理图谱B :pYX212-alsS 的酶切验证，M =Marker, 1 :pYX212_alsS 经酶切后产物，2 :pYX212 经酶切后产物 C :Torulopsis glabrata FMME 055 转化子菌落 PCR 验证，M :Marker，1 Torulopsis glabrata FMME 055,2 :Torulopsis glabrata Δ ura具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本专利技术，下列实施例用于说明目的而非用于限制本专利技术范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。实施例1产2，3- 丁二酮工程菌的构建1.表达载体p^(212-alsS的构建根据KEGG中公布的Bacillus subtilis中alsS基因序列设计PCR引物Al、A2, 从Bacillus subtilis的基因组中扩增出alsS基因，使扩增产物两端分别带上BamH I和 Sal I酶切位点，PCR产物经胶回收、双酶切、纯化后与同样双酶切的表达载体ρ (212连接 (图1Α)、转化JM109感受态，挑取转化子，经酶切验证获得pra212-alsS (图IB)。表IPCR扩增alsS所需要的引物及序列Primer namePrimer sequence(5'-3)'alsS-FCGGGATCCGTTGACAAAAGCAACAAAAGAACAAAalsS-RACGCGTCGACCTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGAG2.构建产2，3- 丁二酮工程菌将带有alsS 基因的表达质粒 pYX212-alsS 电转化！orulopsis glabrata Aura3 感受态细胞，并在MM平板上，30 V培养2-3d，挑取单菌落进行菌落PCR和质粒提取验证(图 1C)，验证正确的阳性转化子在MM培养基上连续转接10代以上，得到稳定遗传的目的工程4|if Torulopsis glabrata FMME 055。实施例2 利用工程菌！orulopsis glabrata FMME 055 生产 2，3_ 丁二酮从甘油管中移取200 μ L光滑球拟酵母工程菌接入种子培养基^mLASOmL锥形瓶)，于30°C、200r/min条件下摇瓶培养24h后，以10%接种量(ν/ν)接入发酵培养基。摇瓶发酵500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，温度为30°C，转速200r/min，发酵时间为72h。实施例3发酵液中2，3- 丁二酮的检测采用顶空气相色谱法测定发酵液中2，3_ 丁二酮的含量，取5mL发酵液上清液，装入22mL顶空瓶，密封供气相色谱分析用。色谱条件如下仪器日本岛津(Shimadzu)GC-2010方法HS/GC/FID色谱柱PEG-20M30M. I. D. 0. 32mm平衡温度70°C平衡时间30min传输线温度130°C进样时间0.04min进样温度200°C检测器温度250°C程序升温40°C(5min)-------180°C (5min)/10°C载气(N2)流量1.2mL/min燃气(H2)流量47mL/min助燃气(Air)流量400ml/min分流比1 1结果表明本专利技术构建的工程菌积累0.63g/L的2，3_ 丁二酮，而出发菌株 Torulopsis glabrata Δura3的发酵液中只检测到0. 008g/L的2，3-丁二酮。表明，外源 alsS的表达明显增强了菌株乙酰乳酸支路的代谢，2，3-丁二酮的产量有着明显的提高。虽然本专利技术已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本专利技术，任何熟悉此技术的人，在不脱离本专利技术的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本专利技术的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种产2，3-丁二酮工程菌，其特征在于在丙酮酸高产菌株Torulosis glabrata的胞质中游离表达了编码乙酰乳酸合成酶基因，乙酰乳酸支路的代谢流量得到增强，促进了 2，3-丁二酮的积累。2.权利要求1所述产2，3-丁二酮工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)克隆乙酰乳酸合成酶基因alsS；2)构建alsS的表达质粒p^(212-alsS；3)将步骤2)得到的质粒转化至受体菌；4)验证所述工程菌。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于步骤1)中乙酰乳酸合成酶的基因来源于芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(LactcAacillus)Jj^ 串珠菌属(Leuconostoc)。4....
【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，高翔，李树波，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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