本发明专利技术基于illumina公司的solexa测序平台提供的DNA标签文库制备方法，设计了长度为6bp独特的标签序列，将标签嵌入DNA接头中，通过连接DNA接头连接来导入标签序列，成功的建立了DNA标签文库的建库方法，并应用于solexa?DNA测序。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸测序
，特别是DNA标签文库制备方法。另外，本专利技术还涉及标签技术，以及实现多个样品在同一反应体系中进行构建标签文库的方法。本专利技术的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是solexa测序技术。
技术介绍
Illumina公司提供的Solexa DNA测序平台，可在一个反应中同时加入四种带荧光标记的核苷酸，采用边合成边测序Gequencing By Synthesis, SBS)，具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点。文库构建首先需要将目的片段进行末端修复，在目的片段的3’末端连接“A”碱基，将3’末端带有A 碱基的目的片段与DNA接头(也称为adapter)连接，通过PCR反应将目的片段进行扩增， 最后回收含有DNA接头的目的片段文库，见附图说明图1。目的片段文库与测序芯片上面的DNA接头进行杂交，通过桥式PCR进行扩增后，最后边合成边测序。在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸，针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光，最后收集到的荧光信号来翻译成碱基序列。目前这种DNA建库方法可以根据需求运用于各种研究领域，如基因组的De Novo测序，基因组重测序、转录组测序和表观基因组测序等。基于上述建库方法iIlumina公司也推出了 DNA标签(也称为index)建库方法， 如图2所示。在DNA标签建库流程中，PCR过程使用了 3条PCR标签引物，通过PCR导入标签来构建DNA标签文库。专利申请W02005068656A1和W02008093098A2中公开了一种使用标签序列标记核酸样品的来源从而可以将样品进行混合测序的方法，可以通过PCR的过程将特定的核苷酸序列(标签序列)通过PCR导入到文库中，PCR标签引物序列见表1。 这些带有标签的文库可以根据需求进行任意混合，然后通过solexa测序仪器进行测序，最后将数据按标签序列进行分类。表1 illumina公司提供的标签(index)序列及相对应的PCR标签引物(indexN PCR引物)序列权利要求1.一组DNA标签，所述DNA标签包括如下或由如下组成表2所示DNA标签或与之相差 1个碱基的DNA标签中的至少5个，或至少10个，或至少15个，或至少20个，至少25个，或至少30个，或至少35个，或至少40个，或45个，或至少50个，或至少55个，或至少60个， 或全部67个，所述DNA标签优选地至少包括表2所示的67个DNA标签的DNA Index-I DNA Index-5,或 DNA Index-6 DNA Index-ΙΟ,或 DNA Index-Il DNA Index-15,或 DNA Index-16 DNA Index-20，或 DNA Index-21 DNA Index-25，或 DNA Index-26 DNA hdex-30，或 DNA Index-31 DNA Index-35，或 DNA Index-36 DNA Index-40，或 DNA Index-41 DNA Index-45，或 DNA Index-46 DNA Index-50，或 DNA Index-51 DNA hdex-55，或 DNA Index-56 DNA Index-60，或 DNA Index-61 DNA Index-65，或 DNA Index-63 DNA Index_67，或者他们任何两个或多个的组合。2.权利要求1所述的DNA标签，其中所述的相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、 添加或删除。3.权利要求1所述的DNA标签用于构建DNA标签文库的用途，其中DNA标签文库的DNA 标签接头在3，末端包含所述DNA标签，从而构成各自相对应的DNA标签接头，所述DNA标签接头优选地同时作为DNA标签文库的5’接头和3’接头使用。4.权利要求1所述的用途，其中所述DNA标签插入DNA标签接头中的3’末端中，或通过或不通过连接子连接在DNA接头的3’末端，优选地不通过连接子连接在DNA接头的3’ 末端。5.含有权利要求1或2所述的DNA标签的一组DNA标签接头，其中DNA标签文库的DNA 标签接头在3’末端包含权利要求1所述的标签，并且优选地同时用作5’接头和3’接头， 所述一组所述DNA标签接头包括如下或由如下组成表2所示67个DNA标签接头与其所包含的DNA标签序列相差1个碱基的DNA标签接头中的至少5个，或至少10个，或至少15 个，或至少20个，至少25个，或至少30个，或至少35个，或至少40个，或45个，或至少50 个，或至少55个，或至少60个，或全部67个，所述DNA标签接头优选地至少包括表2所示的67个DNA标签接头中的DNA Index-IF/ R_adapte DNA Index_5F/R_adapter，或 DNA Index_6F/R_adapte DNA Index_10F/R_ adapter，或 DNA Index_llF/R_adapte DNA Index_15F/R_adapter，或 DNA Index_16F/R_ adapte DNA Index_20F/R_adapter，或 DNA Index_21F/R_adapte DNA Index_25F/R_ adapter,或 DNA Index_26F/R_adapte DNA Index-30F/R_adapter,或 DNA Index_31F/R_ adapte DNA Index_35F/R_adapter，或 DNA Index_36F/R_adapte DNA Index_40F/R_ adapter,或 DNA Index_41F/R_adapte DNA Index_45F/R_adapter,或 DNA Index_46F/R_ adapte DNA Index_50F/R_adapter,或 DNA Index-51F/R_adapte DNA Index_55F/R_ adapter,或 DNA Index_56F/R_adapte DNA Index-60F/R_adapter,或 DNA Index-61F/R_ adapte DNA Index_65F/R_adapter，或 DNA Index_66F/R_adapte DNA Index_67F/R_ adapter,或者他们任何两个或多个的组合。6.权利要求5所述的DNA标签接头，其中所述的相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、添加或删除。7.权利要求5或6所述的DNA标签接头用于构建DNA标签文库的用途，优选地所述DNA标签接头同时用作DNA标签文库的5’接头和3’接头。8.通过权利要求5或6所述的DNA标签接头构建的DNA标签文库。9.一种标签文库的构建方法，所述方法的特征在于使用包含标签的DNA接头来构建标签文库。10.权利要求9所述的方法，其包括1)提供η个D本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：章文蔚，龚梅花，于竞，张艳艳，田方，陈海燕，周妍，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：
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