一种维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法技术

本发明专利技术公开了维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法，包括以下步骤：1)、按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，洗净肠道内容物；2)、将肠道剪切成2～3mm的组织小块；3)、用混合液消化分离肠细胞，得到鱼肠细胞和细胞团；4)、用离心方法分离纯化得到鱼肠细胞团；5)、将分离纯化的鱼肠细胞团计数接种于胶原蛋白涂抹的培养板中进行培养；6)、接种的鱼肠细胞团在24～26℃条件下原代培养，细胞贴壁生长，增殖分化。本发明专利技术根据鱼类肠道组织结构特点，摸索了最佳的鱼肠细胞分离酶的种类、使用浓度和肠细胞团的纯化方法。采用商品胶原蛋白涂抹方便涂抹细胞培养器皿，摸索了最佳的鱼肠细胞接种和密闭培养条件。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种动物肠细胞分离和培养方法，具体涉及一种鱼肠细胞分离、纯化和原代培养方法。
技术介绍
鱼类肠细胞为肠道主要功能性细胞，参与肠道营养物质的消化吸收、免疫屏障和应激反应等多种重要生理过程。同时，肠细胞还是增殖分化最快的一类细胞，对维持肠道黏膜上皮功能正常非常重要。由于神经、体液和许多类群细胞与肠细胞间存在广泛的相互作用，使体内试验研究肠细胞非常困难。而肠细胞体外培养研究模型为研究肠细胞增殖、分化凋亡，营养物质吸收利用及转化提供了准确的手段，是探讨营养物质对肠细胞营养作用机制、重金属及其它有毒有害物质对肠道损伤与肠道修复机制、筛选有益鱼类肠道健康的功能性饲料的理想模型。因此，依据肠细胞的生物学特点，建立体外鱼肠细胞培养研究模型， 对于各相关领域的研究非常重要。目前鱼类肠细胞原代培养已有研究。其方法是采用单一的胶原蛋白酶分离鱼肠细胞，利用鱼皮胶原蛋白为肠细胞贴壁支持物，在二氧化碳培养箱中培养。由于现有培养方法条件要求高，在科学试验研究中应用很少。主要问题表现在以下几个方面(1)现有的鱼肠细胞分离单一使用胶原蛋白酶，需要酶量较大，细胞损伤严重，产率低。肠细胞团比例小，肠细胞贴壁生长困难，细胞接种数量需要量大。因此，需要研究一种更有效的鱼肠细胞分离方法，使分离的肠细胞受损更小，细胞团比例大，增殖分化能力更强。(2)现有的鱼肠细胞贴壁培养方法使用鱼皮胶原蛋白涂抹促进肠细胞贴壁，由于鱼皮胶原蛋白制作程序繁复，无商品试剂购买，实践使用比较困难。因此，需找一种更方便的涂抹材料，以保证接种鱼类肠细胞的贴壁生长效果更好。(3)现有鱼肠细胞原代培养方法采用二氧化碳培养箱进行培养，易受污染，使得培养操作过程比较复杂。因此，寻找一种更为简便的培养方法非常必要。(4)谷氨酰胺是细胞体外培养生长的重要营养物质之一。由于鱼类对谷氨酰胺的代谢利用与陆生温血动物相比差异很大。因此，有必要优化调整谷氨酰胺的使用量。故本研究主要致力于建立简便有效的鱼肠细胞分离和方法，以供研究鱼肠细胞增殖分化和代谢等的需要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种简便有效鱼类肠细胞的分离和原代培养方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种鱼类肠细胞分离和原代培养方法，依次包括以下步骤1、按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，洗净3肠道内容物。2、用眼科剪将肠道剪切成2 3mm的组织小块。3、用胶原酶和中性蛋白酶混合液消化分离肠细胞，得到鱼肠细胞和细胞团。4、用离心方法分离纯化得到鱼肠细胞团。5、将分离纯化的鱼肠细胞团计数接种于胶原蛋白涂抹的培养板中进行培养。6、接种的鱼肠细胞团在M 条件下原代培养，细胞贴壁生长，增殖分化。作为本专利技术的鱼肠细胞体外培养方法的改进步骤幻肠细胞消化分离处理包括以下内容A、混合酶消化液中胶原蛋白酶XI浓度为50IU/ml，中性蛋白酶I浓度为20ug/ ml οB、肠道组织小块与混合消化液的质量体积比大约为1 10。C、组织小块消化液温度为25°C恒温摇床中，100转/分振荡消化70分钟。作为本专利技术的鱼肠细胞体外培养方法的改进步骤4)肠细胞团的分离纯化包括以下内容用S-DMEM液(含3. 5%山梨醇的DNEM培养液)洗涤分离纯化得到的细胞团。作为本专利技术的鱼肠细胞体外培养方法的改进步骤幻肠细胞团的适宜接种数量处理包括以下内容A、利用商品胶原蛋白涂抹细胞培养器皿。B、将分离到的细胞团悬液稀释后在血细胞计数板上计数，以350个细胞团/平方厘米的浓度接于胶原蛋白包被的培养器皿。作为本专利技术的鱼肠细胞体外培养方法的改进步骤6)肠细胞团的培养条件处理包括以下内容A、培养温度以25 为宜。B、所用细胞生长培养液含2. 5%胎牛血清，10yg/ml胰岛素，40μ g/ml转铁蛋白，1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氢钠，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素的DMEM培养液。C、培养液中加入lOmmol/1 Hepes维持pH稳定，密闭培养细胞。与现有技术相比，本专利技术的鱼肠细胞原代培养方法具有以下明显的优点1、本专利技术首次提出用混合酶液消化分离鱼类肠细胞的方法。2、本专利技术根据鱼类肠道组织结构特点，摸索了最佳的鱼肠细胞分离酶的种类、使用浓度和肠细胞团的纯化方法。3、采用商品胶原蛋白涂抹方便涂抹细胞培养器皿，摸索了最佳的鱼肠细胞接种和密闭培养条件。4、本专利技术所述的培养条件和方法，能够帮助初次进行细胞培养的研究人员，比较顺利的完成鱼类肠细胞的分离和原代培养。附图说明图1分离良好的鲤鱼肠细胞团；分离的肠细胞团结构完整，数量多，所占比大。图2接种时的鲤鱼肠细胞团；细胞团和细胞已附着在培养器皿的胶原大白涂抹层上。图3接种培养160小时后生长良好的鲤鱼肠细胞形态；细胞数迅速增加，形成单层并融合成片，为典型的上皮型细胞。图4不同浓度谷氨酰胺对鱼肠细胞增殖的影响。谷氨酰胺能促进鱼肠细胞增殖， 各处理组细胞增殖率分别为35. 24%,81. 53%U08. 07%U16. 56%和114. 65%。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。以下实施例中所用生长培养液的具体配方为01^11培养基，2.5%胎牛血清， 10 μ g/ml胰岛素，40μ g/ml转铁蛋白，1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氢钠，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素。其配制方法如下在200ml DMEM培养基中加入5ml标准胎牛血清、0. 2mg胰岛素、0. 4mg转铁蛋白、220mg谷氨酰胺、0. 84g碳酸氢钠、40000IU的青霉素、 40000IU的链霉素。实施例1 一种鱼肠细胞分离和原代培养方法，依次进行以下步骤1、将体重50克左右鲤鱼2尾，去头，破坏脊髓。体表用75%酒精棉球常规擦拭灭菌，用眼科剪开腹腔，取出整个内脏，放入一个盛有30ml Hanks液的培养皿中。2、用不锈钢小镊子将肠道分离出来，剪取肠道从肠球后面到肠道最后一个自然折前面所有的部分，放入盛有30ml Hanks液的培养皿，小心去除肠道表面的系膜组织，后用注射器将肠腔冲洗干净。3、称重冲净后的肠道组织，然后用眼科剪剪切成2 3mm的组织小块。用Hanks液将冲洗肠道组织小块冲洗干净后，移到50毫升的细胞培养瓶，待到组织小块沉淀下来后， 移去多余的Hanks液，得到大约3g组织小块。4、加入30ml混合消化液，混合消化液中胶原蛋白酶XI为50IU/ml，中性蛋白酶I 为20ug/ml，并加入30000IU青霉素，30000单位链霉素，于25 °C恒温摇床中，振荡器转速 100转/分，振荡消化70分钟。不同消化酶浓度所对应的消化结果如表1所示表1 不同消化酶浓度分离细胞、细胞团的比例(％ )胶原蛋白酶XI(U/ml)中性蛋白酶I(20ug/ml)细胞细胞团30010088121506083178040802050207030 不同浓度消化试验确定其最佳消化酶浓度为胶原蛋白酶XI为50IU/ml，中性蛋白酶 I 为 20ug/ml。 5、轻轻反复吹打消化后的组织块3分钟后，用15毫升S-DMEM液(含3. 5%山梨醇的DNEM培养液)洗涤分离消化细胞培养瓶中的残留物，将洗液转移到50ml离心管中，盖好盖子，1000转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周小秋，姜俊，冯琳，刘扬，胡凯，姜维丹，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：