玉米细菌性萎蔫病菌环介导恒温扩增(LAMP)快速检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用玉米细菌性萎蔫病菌环介导恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒内有模板预处理反应液、恒温扩增反应液Ⅰ。检测玉米细菌性萎蔫病菌的方法包括细菌DNA的提取、模板预处理、LAMP恒温扩增、核酸检测。其优点是简单、快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物检测领域，具体涉及玉米细菌性萎蔫病菌环介导恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
玉米细菌萎蔫病又称玉米细菌性叶枯病、斯氏细菌枯萎病、斯氏叶枯病、玉米欧氏菌萎蔫病等，属全株系统性维管束病害。玉米细菌萎蔫病最初的症状是萎蔫，叶片现灰绿色至黄色线状条斑，有不规则形或波浪形的边缘，与叶脉平行，严重的可延伸到全叶。这些条斑迅速变黄褐干枯，在近地面处茎的髓部变为中空。细菌通过维管束扩展，有时从维管束切口处流出黄色细菌脓液。有的还能进入籽粒。受害株变矮或雄花过早变白死亡。广泛分布在美国加拿大、墨西哥、巴西、秘鲁、圭亚那、意大利、波兰、罗马尼亚、南斯拉夫、泰国、越南马来西亚等，是中国重要外检对象。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种玉米细菌性萎蔫病菌环介导恒温扩增快速检测试剂盒及使用方法。本专利技术的另一目的是提供一种玉米细菌性萎蔫病菌生物检测方法，以克服现有技术的不足，从而为生物安全提供科学的依据和指导作用。本专利技术提供的玉米细菌性萎蔫病菌的恒温扩增快速检测试剂盒，其中包括(1)模板预处理反应液3. 2μ M引物FIP，3. 2μΜ引物ΒΙΡ，0. 4μΜ引物F3， 0. 4μΜ 引物 Β3，800 μ M dNTP, 1 XThermol Buffer，和 ddH20。引物 FIP、BIP、F3 与 B3 的终浓度比为8 8 1 1。所述引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分别如SEQ ID NO :1、2、3和4所示。(2)溶液 I 1 XThermol Buffer, 0. 64U/μ L Bst DNA PolymerasejPddH2O0所述IXThermol Buffer 成分为20mM Tris-HCl (pH8. 8)，IOmM KCl, IOmM(NH4) 2S04,2mM MgSO4,0. 01% Triton X-100，和 ddH20，pH 8. 8。本专利技术提供的利用上述试剂盒检测玉米细菌性萎蔫病菌的方法，包括下列步骤(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD26tZOD28tl在1.6-2.0范围内，浓度在 IO-IOOng/μ L 范围内。(2)模板预处理将装有23 μ L模板预处理反应液的反应管加入2 μ L待检模板DNA于94°C水浴 5min后迅速放入59°C的水浴中45s ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 过程反复进行6个循环，产物用于LAMP模板。(3) LAMP 恒温扩增将上述经过处理的模板预处理混合溶液25 μ L加入25 μ L溶液I中，63°C加热 60min, 80°C IOmin,降温至 4°C。(4)核酸凝胶电泳检测。核酸扩增完成后，扩增结果在琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现条带可以判断为阳性，否则为阴性。本专利技术的试剂盒根据玉米细菌性萎蔫病菌菌株的核糖核酸聚合酶β亚基基因 rpoB保守基因序列设计引物，保证检测方法的特异性。本专利技术采用改进的LAMP扩增技术， 该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特异性强、灵敏度高，特别适用于基层植保机构及植物产品公司与相关检测部门。附图说明图1玉米细菌性萎蔫病菌LAMP扩增图谱，其中1-5样品6阳性对照7 DNA Marker 8阴性对照具体实施例方式本专利技术的主要原理为LAMP引物的设计主要是针对靶基因的四个不同的区域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bi、B2和B3区等4个不同的位点设计4 种引物。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。本专利技术提供的玉米细菌性萎蔫病菌的恒温扩增快速检测试剂盒，其中包括(1)模板预处理反应液其中包括3. 2μ M引物FIP，3.2yM引物ΒΙΡ，0.4μΜ引物 F3，0. 4μΜ 引物 Β3，800 μ M dNTP, 1 XThermol Buffer，和 ddH20。引物 FIP、BIP、F3 与 B3的终浓度比为8 8 1 1。玉米细菌性萎蔫病菌引物F3 5，-AACGCACTACGGTCGTGT-3，(SEQ ID NO 1)B3 5’ -TCGCCTGAGCGATGACAT-3，(SEQ ID NO 2)FIP 5’ -CGTACTCGTTCGTCTGCGCATA-AAACCCCTGAAGGTCCGAA-3’ (SEQ ID NO 3)BIP 5’ -ATCGTCGCTTGATCGACGGTG-CCTTCTTCGATGGCAGACAG-3，(SEQ ID NO 4)(2)溶液 I 1 XThermol Buffer, 0. 64U/μ L Bst DNA PolymerasejPddH2O0IXThermol Buffer 反应缓冲液成分为20mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)，IOmM KCl， IOmM(NH4) 2S04,2mM MgSO4,0. 01% Triton X-100，和 ddH20，pH 8. 8。本专利技术提供的利用上述试剂盒检测玉米细菌性萎蔫病菌的方法，包括下列步骤(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1. 6-2. 0范围内，浓度在 IO-IOOng/μ L 范围内。(2)模板预处理将装有23 μ L模板预处理反应液的反应管加入2 μ L待检模板DNA于94°C水浴 5min后迅速放入59°C的水浴中45s ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 过程反复进行6个循环，产物用于LAMP模板。(3) LAMP 恒温扩增将上述经过处理的模板预处理溶液25 μ L加入25 μ L溶液I中，63°C加热60min， 80°C lOmin，降温至 4°C。(4)核酸凝胶电泳检测核酸扩增完成后，在反应管中加入6XLoading buffer (组分30mM EDTA ；36% (v/v)Glycerol ；0. 05% (w/v)Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v)Bromophenol Blue)，取产物10 μ L加入2%的琼脂糖凝胶板的样品孔中，IOOv电压，电泳30-40分钟，电泳成像系统拍照。扩增结果在琼脂糖凝胶电泳上为梯形核酸条带，如果出现条带可以判断为阳性， 否则为阴性。下列实施例进一步说明本专利技术，但不应当作对本专利技术的限制。 实施例利用玉米细菌性萎蔫病菌环介导恒温扩增检测试剂盒，检测玉米细菌性萎蔫病菌(1)待检样品和玉米细菌性萎蔫病菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1. 6-2. O范围内，浓度在 IO-IOOng/μ L 范围内。(2)模板预处理将装有23 μ L模板预处理反应液的反应管加入2 μ L待检样品模板DNA于94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 过程反复进行 6个循环，产物用于LAMP模板。取2份模板预处理反应液23 μ L，分别加入2 μ L ddH20和玉米细菌性萎蔫病菌 DNA，重复上述相同步骤，产物用作LAMP模板，作为阴性对照和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：封立平，尼秀媚，陈长法，倪新，厉艳，纪瑛，王英超，吴兴海，甘琴华，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：