用于HCV检测的固体支持物制造技术

本发明专利技术涉及用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，其上附着有：a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，和b)至少一种由以下所组成的多肽：(i)HCV?E2蛋白的肽，选自E2蛋白本身及其一或多种表位，和(ii)HCV?E1、NS4B和/或NS5A蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位，以及，在适当的情况下，(iii)NS3蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位；或者：a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)HCV?E2蛋白的肽，选自E2蛋白本身及其一或多种表位，和c)HCV?E1、NS4B和/或NS5A蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位，以及，在适当的情况下，d)NS3蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于HCV检测的固体支持物本专利技术涉及丙型肝炎诊断的领域，以及特别涉及可以用于如下方法的固体支持物，所述方法用于同时检测丙型肝炎病毒(HCV)抗原以及针对HCV蛋白的抗体。用于检测HCV感染的第一代测试是基于针对NS3/NS4非结构蛋白的抗体的检测 (EP 0 318 216 ；Choo et al (1989))，其特别使用了与超氧化物歧化酶融合的约360个氨基酸的蛋白clOO-3。然而，此第一代测试仅能够检测出70%至80%的感染了所述病毒的血清。第二代测试仍是基于对抗体的检测，结合了若干区域特别是核心蛋白以及NS3和 NS4蛋白的抗原(Mimms et al (1990) ；EP 0 450 931)。此第二代测试表现出显著的进步， 因为其灵敏性超过95% (Alter et al(1992))。第三代测试在这些核心、NS3和NS4抗原之外另外增加了 NS5区域的重组蛋白 (Courouce et al(1994))。不过，此检测局限于展现出HCV所引起的慢性肝疾病症状的患者，而对其早期(疑似患有急性期丙型肝炎的患者)的检测很差。例如，此种形式在输血的情况中可以允许通过某些被污染的供血者的血液材料来进行。对病毒本身的检测在污染后以及抗体出现前是必要的且越早越好。这通过使用PCR(聚合酶链反应)扩增技术检测核酸来实现，如Garson et al. (1990)所述。令人遗憾地是，同等地从样品制备、污染风险、和自动化的角度来看，此种技术的进行依然很复杂。用于HCV感染早期检测目的的另一种手段是检测核心蛋白的循环病毒抗原，如Takahashi et al (1992)所述，不过可检测的核心抗原的量低且此种测定法的进行依然很复杂。为了克服这些缺陷，用于组合HCV抗原及针对HCV的抗体的检测的测定法(称作 COMBO)代表了一种为了得益于以下二者的良好平衡，即通过抗原的检测而实现的早期检测和通过抗体的检测而实现的对患者慢性状况的监测。然而，这引起了一个主要的问题，也即干扰的问题，其涉及到HCV核心抗原的测定中在血清中存在的抗-HCV抗体与用于检测抗原的经标记抗HCV抗体之间的干扰。此种问题尤其存在于在同一固相上对抗HCV核心蛋白抗体和HCV核心抗原进行同时检测的系统中。因此，为了检测抗HCV核心蛋白抗体而将具有相同表位(由用于检测核心抗原的经标记的抗HCV核心蛋白抗体所识别)的核心抗原安置(cbposit)于固相上，会使得经标记的抗体附着至所述固相并导致所述测定的假阳性反应。类似地，在组装固体支持物(其上需要附着核心抗原和抗核心蛋白抗体)的过程中，不可能用含有此二种成分的混合物的溶液来包被固相，否则抗体的位点会被用于包被固体支持物的抗原所封闭，阻止了所述抗体随后与患者血清抗原的反应。因此这些竞争现象非常不利于有效测试的开发。WO 00/07023提出了检测核心抗原和抗核心蛋白抗体的COMBO测试，其中，为了避免干扰的问题，被选择用于试剂盒各种成分的核心蛋白表位是不同的。由于核心表位的数目并不是无限的，因此此种技术具有使用识别很差的次要表位的缺陷。WO 2008/027942中描述的手段类似，但却系统化地组合了最大数目的核心蛋白和抗核心蛋白单克隆抗体的非重叠表位，仍旧是为了克服此种干扰的问题。3EP 1 251 353使用了相同的技术，却用更完整的抗原混合物(NS3、NS4、NS5、核心)来检测抗体，但是仍存在此种核心蛋白的干扰问题。WO 03/095968通过对用于抗体捕获的抗原的某些靶表位进行结构修饰(特别是通过氨基酸取代)来解决此种问题。经如此修饰的表位因而被破坏。同时，用于捕获和/ 或检测抗原的抗体是经过选择的，从而其事实上识别患者抗原上存在的未经修饰的表位， 并且其因而不能结合经修饰的抗原(不再具有同样的表位)。由于表位不再相同，因而用于捕获和/或检测HCV抗原的抗体与患者的抗体之间不再存在竞争。核心抗原的捕获和抗核心蛋白抗体的捕获将能够在核心蛋白的同一蛋白区域进行并且将避免一定数目的抗核心蛋白抗体检测的损失。WO 03/002749中描述了类似的策略，其中的核心蛋白经修饰从而某些表位不被该测定法中所使用的单克隆抗体所识别。WO 01/096875描述了 COMBO测定法，其中通过组合检测HCV核心抗原和针对NS3/ NS4a 680个氨基酸(aa)的蛋白中存在的非连续表位的抗体来解决此种干扰问题。然而，此种应用中的灵敏性/特异性结果非常有限并且未证明其灵敏性水平足以用于检测测试。因此，需要组合的抗原和抗体HCV检测测试，其是灵敏且特异的、尽可能的简单、 并且其避免了抗原和针对核心蛋白的抗体之间的干扰问题。为了此目的，发现了用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，其上附着有a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)和包含以下的至少一种多肽HCV的E2蛋白的至少一种表位以及选自HCV的E1、NS3、NS4和NS5的蛋白的至少一种表位，并且其上的所述至少一种多肽不含有HCV核心蛋白的表位。具体而言，用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物上附着有a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)包含HCV的E2蛋白的至少一种表位的至少一种多肽，c)和包含选自HCV的E1、NS3、NS4和NS5的蛋白的至少一种表位的至少一种多肽，并且在所述支持物上的所述至少一种多肽不含有HCV核心蛋白的表位。本专利技术也提出了用于在体外检测生物学样品中的HCV感染的方法，其包括检测所述生物学样品中存在的至少一种HCV抗原以及针对HCV的抗体，并且其中提供如上所述的支持物，在使得抗原-抗体复合物形成的条件下将所述支持物与所述生物学样品进行温育，显现所形成的抗原-抗体复合物。有利的是，本专利技术的固体支持物包含或由如下所组成a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的E2蛋白的至少一种表位和c) 包含或由如下所组成的至少一种多肽选自HCV的NS3、NS4和NS5 (优选NS4B和NS5A)的蛋白的至少一种表位。更有利的是，本专利技术的固体支持物包含或由如下所组成a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的E2蛋白的至少一种表位和 c)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的NS3的至少一种表位和选自HCV的NS4及 NS5的蛋白的至少一种表位。优选的是，本专利技术的固体支持物包含或由如下所组成a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的E2蛋白的至少一种表位和c) 包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的NS3的至少一种表位和选自HCV的NS4B及 NS5A的蛋白的至少一种表位。在本专利技术的另一个实施方案中，本专利技术的固体支持物包含或由如下所组成a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的E2蛋白的至少一种表位和c)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的NS4B蛋白的至少一种表位和HCV的NS5A蛋白的至少一种表位。在任何的情况中，都没有包含HCV核心蛋白表位的多肽附着于所述固体支持物。术语“HCV” (丙型肝炎病毒)涵盖了引起丙型肝炎的病毒的所有病毒株、类型、亚型、和基因型。这包括了 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．用于检测ＨＣＶ的免疫学测试的固体支持物，其上附着有：ａ）至少一种针对ＨＣＶ核心蛋白的抗体，和ｂ）由以下所组成的多肽：（ｉ）ＨＣＶ的Ｅ２蛋白的肽，选自Ｅ２蛋白本身及其一或多种表位，和（ｉｉ）ＨＣＶ的Ｅ１、ＮＳ４Ｂ和／或ＮＳ５Ａ蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位，以及，在适当的情况下，（ｉｉｉ）ＮＳ３蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JL·贝兰，G·帕拉尼奥斯巴卡拉，
申请(专利权)人：生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：FR