木糖异构酶基因及其在戊糖发酵中的用途制造技术

本发明专利技术涉及具有将木糖直接异构化为木酮糖的能力的真核细胞。所述细胞通过转化了编码木糖异构酶的核苷酸序列而获得这个能力，所述木糖异构酶具有异构酶典型的一或多个特异性序列元件，具有在酵母中功能性表达的能力，例如可得自梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）和梭杆菌（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属细菌或者玻璃海鞘（Ｃｉｏｎａ）属的被囊动物（ｔｕｎｉｃａｔｅ）的木糖异构酶。所述细胞优选是酵母或者丝状真菌，更优选是能厌氧成醇发酵的酵母。可进一步包含一或多种遗传修饰，其增加戊糖磷酸途径的通量、降低非特异性醛糖还原酶活性、赋予细胞增加特异性木酮糖激酶活性的能力、将Ｌ－阿拉伯糖转化为Ｄ－木酮糖５－磷酸酯、增加木糖和阿拉伯糖至少之一向宿主细胞中转运、降低分解代谢产物阻抑的敏感性、增加乙醇、摩尔渗透压浓度或者有机酸耐受性；和／或降低副产物的产生。所述细胞优选是具有产生发酵产物的能力的细胞，所述发酵产物如乙醇、乳酸、３－羟基－丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、１，３－丙二醇、乙烯、甘油、β－内酰胺抗生素以及头孢菌素类。本发明专利技术进一步涉及生产这些发酵产物的方法，其中本发明专利技术的细胞用于将木糖发酵成为所述发酵产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】木糖异构酶基因及其在戊糖发酵中的用途专利
本专利技术涉及编码木糖异构酶的核酸序列在转化真核微生物宿主细胞用以赋予该宿主细胞将木糖异构化为木酮糖的能力中的用途。经转化的宿主细胞被用于通过含戊糖培养基的发酵来产生乙醇及其它发酵产物的方法。专利技术背景经济上可行地从植物生物质的半纤维素部分中生产乙醇需要以相对等的速率并且以高产量同时转化戊糖和己糖。酵母，特别是糖酵母(Saccharomycesspp.)，对于这种方法是最合适的候选，因为其可以在己糖上在需氧和厌氧条件下均快速生长。此外，其对于木质纤维素水解产物的毒性环境比(遗传修饰的)细菌更具抗性。尽管野生型啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株可缓慢地代谢戊糖木酮糖，但是其不能代谢木糖。在二十世纪八十年代，已有建议用于木糖利用的酵母代谢工程应当基于木糖异构酶(XI，EC5.3.1.5)的引入，而不是表达异源木糖还原酶和木糖醇脱氢酶以将木糖转化为木酮糖。遗憾地是，在啤酒糖酵母中引入细菌木糖异构酶的所有尝试除了值得注意的嗜热栖热菌(T.thermophilus)异构酶之外均未能产生功能性表达的木糖异构酶。这种酶在啤酒糖酵母中功能性表达，但是在生长许可温度仅观测到非常低的活性。当厌氧真菌PiromycesSp.E2中新发现的木糖异构酶被引入啤酒糖酵母中时，这种情况发生了彻底的改变，并且观测到高水平的酶活性使得这个菌株能够厌氧生长并从木糖产生乙醇(WO03/062340和WO06/009434)。此种酵母株首次提供了能与商业规模的乙醇生产相容的木糖消耗和乙醇形成的比速率。自从发现了Piromyces木糖异构酶在酵母中的功能性表达，出现了其它木糖异构酶在酵母中功能性表达的若干报道，所有这些均与Piromyces酶具有70％以上的氨基酸序列相同性，例如来自拟杆菌(Bacteroides)(WO04/099381，WO06/009434，WO09/109633)的细菌木糖异构酶，以及来自Cyllamyces(WO04/099381)和Orpinomyces(Madhavanetal.，2008，DOI10.1007/s00253-008-1794-6)的真菌木糖异构酶。然而，在2008年12月24日之前，对于与Piromyces酶具有低于70％氨基酸序列相同性的木糖异构酶在酵母中功能性表达没有报道。最近，在2009年2月，Brat等(2009，Appl.Environ.Microbiol.75：2304-2311)公开了来自厌氧菌Clostridiumphytofermentans的木糖异构酶在酵母啤酒糖酵母中的功能性表达，其与Piromyces酶的氨基酸序列仅具有52％的相同性。迄今为止，450余种木糖异构酶序列可公开得自Genbank及其它序列数据库，包括Piromyces、Cyllamycesaberensis、小立碗藓(Physcomitrellapatens)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、睡眠嗜血菌(Haemophilussomnus)、玻璃海鞘(Cionaintestinalis)、难辨梭菌(Clostridiumdifficile)、海栖热袍菌(Thermatogamaritime)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、Burkholderiaphytofirmans、金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)及死亡梭杆菌(Fusobacterium_mortiferum)的木糖异构酶序列。然而，本领域仍需要编码其它木糖异构酶的核苷酸序列，其可被用于转化宿主细胞如啤酒糖酵母以赋予它们将木糖异构化为木酮糖的能力，从而使得如此转化的宿主细胞能被用于通过含戊糖原料的发酵而生产乙醇或者其它发酵产物的方法。专利技术描述定义酶“木糖异构酶”(EC5.3.1.5)在本文被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖以及反之的酶。所述酶也被称作D-木糖酮异构酶(ketoisomerase)。一些木糖异构酶也能催化D-葡萄糖与D-果糖之间的转化，因此有时也被称作葡萄糖异构酶。木糖异构酶需要镁作为辅因子。本专利技术的木糖异构酶可以由其氨基酸序列来进一步定义，如下文所述。类似地，木糖异构酶可以由编码该酶的核苷酸序列以及由与编码木糖异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义，如下文所述。木糖异构酶活性的单位(U)在本文被定义为在含有50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)、10mM木糖和10mMMgCl2的反应混合物中于37℃每分钟产生1nmol木酮糖的酶的量。所形成的木酮糖通过Dische和Borenfreund(1951，J.Biol.Chem.192：583-587)所述方法或者通过实施例中所述HPLC来确定。序列相同性在本文被定义为通过对比序列所确定的两个或更多个氨基酸序列(多肽或蛋白)或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“相同性”也是指氨基酸或者核酸序列之间序列相关性的程度，该情况可以通过此种序列串的匹配来确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代与另一多肽的序列对比而确定的。“相同性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算。术语“序列相同性”或者“序列相似性”是指，当最佳比对时，优选针对(至少对比中的最短序列的)全长并最大化匹配数及最小化空位(gap)数(如通过程序ClustalW(1.83)、GAP或者BESTFIT以默认参数进行)，则两个(多)肽或者两个核苷酸序列呈现出至少一定百分比的序列相同性(如本文别处所定义的)。GAP使用Needleman和Wunsch整体比对算法以在全长上比对两个序列，使匹配数最大化及使空位数最小化。通常，使用GAP默认参数，空位生成罚分(gapcreationpenalty)＝50(核苷酸)/8(蛋白质)以及空位延伸罚分(gapextensionpenalty)＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，所使用的默认得分矩阵(defaultscoringmatrix)是nwsgapdna，而对于蛋白质，默认得分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。用于比对本专利技术蛋白质序列的优选多重比对程序是ClustalW(1.83)，其使用blosum矩阵(blosummatrix)及默认设置(空位开放罚分：10；空位延伸罚分：0.05)。应清楚的是当RNA序列被称作与DNA序列基本相似或者其与DNA序列具有一定程度序列相同性时，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。百分比序列相同性的序列比对和得分可以使用计算机程序来确定，如可得自AccelrysInc.，9685ScrantonRoad，SanDiego，CA92121-3752USA的GCGWisconsin软件包，版本10.3，或者用于Windows的开源软件Emboss(当前版本为2.7.1-07)。或者，百分比相似性或百分比相同性可以通过针对数据库如FASTA、BLAST等的检索来确定。确定相同性的优选方法，被设计为给出所测序列之间最大匹配。确定相同性和相似性的方法在公众可获得的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种包含核苷酸序列的真核微生物细胞，所述核苷酸序列的表达在细胞中赋予了或者增加了直接将木糖异构化为木酮糖的能力，其中所述核苷酸序列编码具有木糖异构酶活性的多肽，所述多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列含有选自由如下组成的组的一或多个氨基酸序列元件：（ａ）在第９１位的甲硫氨酸残基，（ｂ）在第１３４－１３９位的氨基酸序列ＴＧＩＫＬＬ，（ｃ）在第２３０位的苯丙氨酸残基，（ｄ）分别在第２６４和２６５位的氨基酸苯丙氨酸和赖氨酸，（ｅ）在第２７４－２７８位的氨基酸序列ＴＬＡＧＨ，（ｆ）在第３８７－３９１位的氨基酸序列ＲＹＡＳＦ，（ｇ）在第３９４位的甘氨酸残基，以及（ｈ）在第４３１位的丙氨酸残基，其中所述多肽不包含与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３－７之一具有９５％以上序列相同性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP08172919.62008年12月24日1.一种包含核苷酸序列的真核微生物细胞，所述核苷酸序列的表达在细胞中赋予了或者增加了直接将木糖异构化为木酮糖的能力，其中所述核苷酸序列编码具有木糖异构酶活性的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列：(i)是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列，或者通过一或多个氨基酸的取代、缺失或插入的方式衍生自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列，其中所述氨基酸的取代、缺失或插入位于对结构和酶活性重要的保守区域或位置之外；(ii)含有木糖异构酶标签序列：在第187-195位的VXW[GP]GREG[YSTA]和在第232-239位的[LIVM]EPKPX[EQ]P；(iii)含有保守的催化氨基酸残基His-102、Asp-105和Asp-340；(iv)含有在第91位的甲硫氨酸残基；和(v)含有选自由如下组成的组的一或多个氨基酸序列元件：(a)在第134-139位的氨基酸序列TGIKLL，(b)在第230位的苯丙氨酸残基，(c)分别在第264和265位的氨基酸苯丙氨酸和赖氨酸，(d)在第274-278位的氨基酸序列TLAGH，(e)在第387-391位的氨基酸序列RYASF，(f)在第394位的甘氨酸残基，以及(g)在第431位的丙氨酸残基，其中(ii)-(v)中的氨基酸位置以及序列元件(a)-(g)中的氨基酸位置是指参照SEQIDNO:3的氨基酸序列的位置，并且其中所述多肽不由与SEQIDNO:3-7之一具有90%以上序列相同性的氨基酸序列所组成。2.权利要求1的真核微生物细胞，其中所述具有木糖异构酶活性的多肽的氨基酸序列还含有在第230位的苯丙氨酸残基、在第264位的苯丙氨酸残基和在第265位的赖氨酸残基。3.权利要求1的细胞，其中所述核苷酸序列编码可得自梭菌(Clostridium)菌属的细菌或者玻璃海鞘(Conia)属的被囊动物的氨基酸序列。4.权利要求1的细胞，其中所述细胞是选自由如下组成的组的属的酵母或者丝状真菌：糖酵母(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母(Kluyveromyces)、假丝酵母(Candida)、毕赤氏酵母(Pichia)、裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)、汉逊氏酵母(Hansenula)、克勒克氏酵母(Kloeckera)、许旺氏酵母(Schwanniomyce...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·W·R·H·特尼桑，
申请(专利权)人：C五酵母有限责任公司，
类型：发明
国别省市：NL