本发明专利技术提供了用于发酵生产制甲羟酶素、洛伐他汀、普伐他汀或辛伐他汀的方法，所述方法包括培养包含来自Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｒｅｒｒｅｕｓ的ｌｏｖＥ转录调节子基因的多核苷酸的宿主（优选丝状真菌）。另外，本发明专利技术提供了用于生产上述斯达汀的、包含来自Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｒｅｕｓ的ｌｏｖＥ转录调节子基因的多核苷酸的宿主。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及斯达汀的发酵方法。
技术介绍
斯达汀(statin)类的降胆固醇剂是非常重要的药物，因为它们通过抑制HMG-CoA 还原酶降低血中的胆固醇浓度。后一酶催化胆固醇生物合成中的限速步骤，即(3S)-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)到甲羟戊酸的转化。市场上存在若干种类型的斯达汀，其中有阿托伐他汀(atorvastatin)、制甲羟酶素、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀 (simvastatin)和普伐他汀。阿托伐他汀通过化学合成制造，而上文提到的其它或者通过直接发酵或者通过前体发酵生产。这些(前体)发酵通过Penicillium、Aspergillus和 Monascus属的真菌进行。在异源宿主(即如Penicillium chrysogenum等宿主，其天然不生产斯达汀且其中弓I入了来自天然斯达汀生产者例如Penicillium citrinum或Aspergillus terreu 的完整斯达汀途径基因)中发酵这些化合物时存在常见问题，因为使用的异源菌株的生产力和产率较低。早前公开了若干技术，包括通过UV诱变进行对斯达汀生产菌株的经典改进(J. Gen. Appl. Microbiol. (2004)，Vol. 50，p. 169-176)。另外，描述了用对应于来自 Penicillium citrinum的基因mlcR的多核苷酸对斯达汀生产生物Penicillium citrinum 的转化。然而，这两种技术均未导致异源宿主中斯达汀生产的改进。尽管WO 2007/122249 中公开了使用以工业水平进行生产的Penicillium chrysogenum菌株的另一途径，但是此种途径的问题在于用于工业生产的微生物不总是可获得的和/或合适的。仍然存在对替代性途径的需要。专利技术详述术语“表达”包括涉及多肽生产的任何步骤，其可包括转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。当核酸构建体含有编码序列在特定宿主生物中表达所需的所有控制序列时，术语 “核酸构建体”与术语“表达载体”或“盒”同义。术语“控制序列”在本文中被定义为包括对多肽的表达来说必需的或有利的所有组件。每种控制序列对编码多肽的核酸而言可以是内源的(native)或外源的(foreign)。 这类控制序列可包括，但不限于启动子、前导序列、最适翻译起始序列(如Kozak，1991， J. Biol. Chem. 266 19867-19870中所述)、分泌信号序列、前肽序列、多聚腺苷酸化序列、转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以是含有转录控制序列的适当的启动子序列。启动子可以是在细胞中显示转录调控活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂交的启动子，它们可得自编码细胞外或细胞内多肽的基因。启动子对细胞或多肽而言可以是同源的或异源的。启动子可以源自供体物种，或源自任何其它来源。控制真核生物中表达水平的一种备选方式是使用内含子。高等真核生物具有由外显子和内含子组成的基因。术语“外显子”在本文中被定义为包括开放读码框(ORF)的所有组件，其被翻译为蛋白质。术语“内含子”在本文中被定义为包括所有不包括于开放读码框中的组件。术语“开放读码框”在本文中被定义为下述多核苷酸，其从甲硫氨酸的密码子序列ATG开始，随后是连续的一串编码所有可能的氨基酸的密码子，在一定数量后被终止密码子打断。该开放读码框可以被翻译为蛋白质。含有分离自基因组的基因的多核苷酸是该基因的所谓的基因组DNA或gDNA序列，其包括所有外显子和内含子。含有通过反转录反应分离自mRNA的基因的多核苷酸是该基因的所谓的拷贝DNA或cDNA序列，其仅包括外显子，而内含子通过细胞机制被切除。后一类型的DNA尤其适用于在原核宿主中表达感兴趣的真核基因。也可以合成制造两种类型DNA的变体，这使得改变内含子的确切核苷酸序列或改变感兴趣的基因中内含子数量成为可能。这也使得向来自原核起源的感兴趣的基因中添加内含子以简化或改进在真核宿主中的表达成为可能。另外，也可以在上述控制序列如启动子、多聚腺苷酸化位点或转录终止子中引入内含子。内含子的存在、不存在、变异或引入是调节真核细胞中基因表达水平的一种手段。术语“可操作地连接”在本文中被定义为下述构型，其中控制序列被适当地置于与 DNA序列的编码序列相关的位置，使得控制序列能指导多肽的生产。术语“普伐他汀”在本文中被定义为在6'位置上具有α-或β-构象的6'-羟基取代的制甲羟酶素，或α-和构象二者的混合物，并包括闭合的结构(带有内酯环) 和开放的结构(具有羟基羧酸部件)二者。在本专利技术的上下文中，制甲羟酶素、普伐他汀、无锡他汀(WUXistatin)、红曲米素 J(monacolin J)、洛伐他汀和/或辛伐他汀(通常称作“斯达汀”)“生物合成基因”或“生物合成途径”包括编码直接涉及斯达汀分子合成的酶的所有基因，编码斯达汀分子的分泌中的酶的所有基因，和编码涉及前两类基因的转录调节的蛋白质的所有基因。此外，还包括能够生产斯达汀的微生物宿主的所有下述基因，所述基因通过过表达或失活引起生产能力的显著改变(即分别导致生产至少增加20%的斯达汀或生产至少减少20%的斯达汀)。特定的基因是(但不限于)=Penicillium citrinum的制甲羟酶素生物合成基因簇(即mlcA、 mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcH、mlcG、mlcR，见 Entrez 数据库登记号 AB072893 ；Abe Y, Suzuki Τ,Ono C, Iwamoto K, Hosobuchi M and Yoshikawa H, MoI Genet Genomics 2002, 267 636-646)，Aspergillus terreus 的洛伐他汀生物合成基因簇(即 0RF1、0RF2、ΙονΑ、 0RF5、lovC、lovD、0RF8、lovE、0RF10, IovF, 0RF12、0RF13、0RF14、0RF15、0RF16、细胞色素 P450 单氧合酶、0RF18 ；见 Entrez 数据库登记号 AF141924 和 AF141925 ；Kennedy J, Auclair K,Kendrew SG,Park C,Vederas JC and Hutchinson CR,Science 1999,284:1368-1372)， Monascus pilosus 的红曲米素 K 生物合成基因簇(即 mkA、mkB、mkC、mkD、mkE、mkF、mkG、mkH 禾口 mkl ；见 Entrez 数据库登记号 DQ17659，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer, fcgi ？ db = nuccore&id = 74275560)，及其源自其它物种的基本同源物。实际的斯达汀生物合成途径可得自单个供体宿主或得自多于一个宿主，或(部分)由合成的多核苷酸组成。就本专利技术的目的而言，两条氨基酸序列之间的同一性程度是指两条序列之间相同的氨基酸的百分比。使用BLAST算法测定同一性程度，所述BLAST在Altschul，et al. (J. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．包含下述异源斯达汀（ｓｔａｔｉｎ）生物合成基因转录活化子的真菌菌株，所述活化子是基因ｌｏｖＥ或与ｌｏｖＥ至少７５％同源的多核苷酸，其特征在于所述真菌菌株不是Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：马尔科·亚历山大·范德勃戈，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL
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