用于快速鉴定与特定化学靶点结合的核酸的装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及微流体芯片以及它们在ＳＥＬＥＸ中的使用。所述微流体芯片优选的包括具有含靶点的高表面积材料的反应室。一种优选的高表面积材料是溶胶－凝胶衍生材料。本发明专利技术还描述了制作微流体芯片的方法，以及使用这些装置针对靶点筛选核酸适体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术是有关快速鉴定与生物靶点和化学靶点特异结合的核酸的装置和方法。
技术介绍
SELEX (指数富集配体系统进化)过程是一种进化的体外组合化学过程，用于从含多种寡聚核苷酸的核酸池中识别出与某个配体或靶点相结合的核酸适体。SELEX是用于在特定的可控的结合条件下从随机池中分离核酸适体的优秀系统。SELEX技术为产生与指定配体或靶点紧密特异结合的单链DNA或RNA寡聚核苷酸提供了另一途径(Tuerk et al., Science 249:505-510(1990) ；Ellington A. ,Curr Biol 4:427-429(1994) ；Ellington et al.，Nature346 :818-822 (1990))。目前SELEX实验已被开发用于研究核酸的功能与结构， 而识别出的核酸适体已成为分子诊断、分子识别、分子生物学以及分子进化研究的重要工具(Uphoff et al. , Curr Opin Struct Biol 6 :281-288(1996))。在SELEX过程中，核酸适体的筛选是通过反复进行相继的靶点结合、去除未结合的寡聚核苷酸、洗脱、扩增和纯化筛选出的寡聚核苷酸这些步骤而实现富集。SELEX涉及两个过程的多轮重复(i)使用亲和技术将高亲和性的核酸适体从低亲和性核酸适体中分离或筛选出来，以及(ii)使用聚合酶链式反应(PCR)扩增所筛选出的核酸适体。核酸适体一般是在SELEX过程的分离步骤中，使用亲和筛选技术，从大量的随机DNA或RNA序列池或库(彡IO15种序列)中筛选得到。被称为“核酸适体”的单链DNA或RNA是人工合成的特定寡聚核苷酸，它们能以高亲和力和特异性与非核酸靶点分子结合(Jenison et al.，Science 263:1425(1994) ；Patel et al.，J Mol Biol 272:645-664(1997) ；Clark et al.，Electrophoresis 23 1335-1340 (2002)) 鉴于核酸适体独特的性质，它们对于推动从亲和分离到疾病的诊断与治疗，如癌症和病毒感染的诊断和治疗，的自然科学和生命科学的多个领域的革新有良好的前景(Tang et al.，Anal Chem 79 =4900-4907(2007)； Gopinath, S. , Archives of Virology 152:2137-57(2007))。相对于抗体，核酸适体具有很多优势。它们更小，更稳定，能够化学合成，以及能够未检测使用荧光标记同时不影响他们的亲和力。与抗体的研发不同，它们针对毒性靶点(当用于抗体生成)或针对低免疫原性或无免疫原性的靶点的开发是可行的(Marm et al.，Biochem Biophy Res Comm 338 1928-1934(2005)) 此外，由于它们便捷的制备过程和广泛的用途，它们能够作为验证胞内和胞外靶点的有力工具(Gopinath，S.，Anal Bioanal Chem. 387 :171-182 (2007)) 0 一组核酸适体还可以用于选择性的干扰某个“轴心” 蛋白的部分的连接(Shi et al. , Proc Nat，1 Acad Sci USA 104 :3742-3746 (2007)) 微流体装置是指使用微米尺度的通道操作非常小量体积( 10_9_10_18升)液体的系统。对小量体积的操作通过减少扩散时间提供了高速的化学反应，并在输运、交换和安置化学试剂到指定位置这些方面对获取的样本本液体提供了精确的控制。通过微加工技术，微流体装置还能够在单个芯片中整合流体元件如微泵、微阀、微加热器等等，从而使所有化学过程在芯片能自动完成。由于这些因素，微流体装置被广泛的应用于化学、生物学、药学和工程学领域，以实现高速和高通量的样本分析(Whitesides，G.，Nature 442 368-373(2006))ο 在实际应用中，传统SELEX系统重复工作多且耗时，不适用于进行高通量筛选。虽然SELEX技术本身已充分成熟，但其相对低的通量阻碍了需要大量不同核酸适体的研究， 如针对生物标记识别的蛋白质组学研究。提高SELEX核酸适体产生速度和筛选能力的一种途径是过程的自动化和微型化。近来，用于快速和高通量分析的宏观技术的微型化方面已取得了进展。小型化的优势包括1)样本消耗小，2)能进行高通量分析，3)自足体系，4)交叉污染减少，以及 5)多功能整合(Gopinath，S，Anal Bioanal Chem. 387 171-182 (2007)) 用于分离特定RNA核酸适体的SELEX技术可实现自动化，从而显著的减少分离和扩增能以高亲和力与特定目标靶点分子结合的寡聚核苷酸序列所需要的时间。近来，一些微流体实验流程已被用于开发更快的SELEX过程，显著地将SELEX产生核酸适体的时间从几个月/ 周缩短至几天(Hybarger，et al. ,Anal Bioanal Chem 384 :191-198(2006) ；Windbichler, et al. , Nat. Protoc. 1 :637-640(2006) ；Eulberg, et al. , Nucleic Acids Research 33 e45(2005))。SELEX技术的大多数进展，旨在提高筛选的效率(Bunka et al.，Nat Rev Micro 4:588-596(2006)).但是，这些研究并没有采用微型化的或多路的核酸适体筛选。SELEX的过程还具有标准化的潜力，如果系统能整合至基于芯片的微流体环境内，将会在快速分析、减少成本和高通量分析这些方面提供显著的优势。这样的优势已在基于芯片的酶分析(Hadd et al.，Anal Chem 69:3407-3412(1997) Joseph W., Electrophoresis 23 :713-718(2002))和免疫分析(Wang et al. , Anal Chem 73: 5323-5327(2001) ；Sato et al.，Anal Chem 73 :1213-1218(2001))中得到了证明。传统SELEX筛选技术还存在一些缺陷。传统筛选过程的一个缺陷是所筛选出的核酸适体对结合至固定支持物而非溶液中自由的靶点分子具有亲和性。进化的SELEX过程所筛选出的核酸适体是结合至与靶点类似的分子(即，它的膜结合衍生物)，而不是集中于对期望的靶点有亲和力的核酸适体。有报道指出筛选出的结合至cAMP的核酸适体实际上对 C8位点修饰的cAMP类似物具有更高的亲和力，该位点是靶点附着在固定支持物上的位点 (Koizumi et al.，Biochem. 39 :8983-8992 (2000))。这样，固定支持物的影响在针对更小的配体筛选核酸适体时会被放大，这是由于更小配体只有有限数量的功能位点能与核酸适体相互作用，并且将配体附着至固定支持物上则进一步减少了这些功能位点的有效性。固定支持物本身还会引出其他的问题。有报道表明传统SELEX中以自由靶点溶液把有效序列从柱上去除的清洗步骤可能忽略对靶点有很高亲和力的核本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种微流体装置，包括：包括在输入口和输出口之间延伸的一条或者多条流体通道的基底，位于所述一条或者多条流体通道中的分子结合区，其中，分子结合区包括靶点分子；以及邻近分子结合区的加热元件。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/089,2912008年8月15日1.一种微流体装置，包括包括在输入口和输出口之间延伸的一条或者多条流体通道的基底，位于所述一条或者多条流体通道中的分子结合区，其中，分子结合区包括靶点分子；以及邻近分子结合区的加热元件。2.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述加热元件包括位于基底表面的电极。3.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述基底包括玻璃、硼硅酸玻璃、玻璃陶瓷以及高分子材料的一种或多种。4.如权利要求3所述的微流体装置，其中，所述基底是玻璃或硼硅酸玻璃底座和高分子材料盖的组合，它们共同限定了所述一条或者多条流体通道。5.如权利要求1所述的微流体装置，其还包括包裹所述加热元件的高分子材料涂层， 从而使液体流过流体通道时不会直接与所述加热元件接触。6.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述分子结合区是在所述高分子材料涂层上形成。7.如权利要求6所述的微流体装置，其中，所述高分子材料涂层为聚(甲基)丙烯酸8.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述分子结合区包括具有所述靶点分子的高表面积材料。9.如权利要求8所述的微流体装置，其中，所述高表面积材料为溶胶-凝胶衍生产物， 水凝胶衍生产物，高分子刷衍生产物，硝化纤维素膜包裹产物，或者基于树状聚合物的产物。10.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述分子结合区包括所述一条或者多条流体通道的表面，这些流体通道包括一种或者多种联接分子，能够使所述靶点分子附着至所述区域内的表面。11.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述靶点分子是蛋白质或多肽，糖类，脂类，制药剂，有机非制药试剂，或者高分子复合物。12.如权利要求1所述的微流体装置，其还包括至少一个位于所述输入口和输出口之间并且与所述一条或者多条流体通道流体连接的微室，以及基本位于与所述加热元件邻近的所述微室内的溶胶-凝胶材料。13.如权利要求12所述的微流体装置，其中，所述至少一个微室包括两个或者更多微室。14.如权利要求13所述的微流体装置，其中，所述两个或者多个微室包括相同的靶点分子。15.如权利要求13所述的微流体装置，其中，所述两个或者多个微室包括不同的靶点分子。16.如权利要求1所述的微流体装置，其还包括与输入口连通的多端口耦合装置。17.如权利要求16所述的微流体装置，其还包括一个或者多个和所述多端口耦合装置连通的储液池，所述一个或者多个储液池各自含有洗涤缓冲液、封阻缓冲液、结合缓冲液或含有核酸分子群体的溶液。18.—种筛选与一个或者多个靶点分子结合的核酸适体的方法，包括 提供如权利要求1-17任一所述的微流体装置；以及在核酸分子与靶点分子能够有效特异结合的条件下，将核酸分子群体导入至微流体装置中；从微流体装置中基本去除所有不与靶点分子特异结合的核酸分子； 使所述加热元件加热，致使与靶点分子特异结合的核酸分子变性；以及回收与靶点分子特异结合的核酸分子，这些回收获得的核酸分子即是筛选出的特异结合至靶点分子的核酸适体。19.如权利要求18所述的方法，其中，所述核酸适体包括RNA核酸适体，所述方法还包括对筛选出的核酸适体群体进行逆转录扩增。20.如权利要求19所述的方法，还包括 对经扩增的核酸适体群体进行纯化和测序。21.如权利要求20所述的方法，其中，所述回收，所述逆转录扩增，所述纯化，和/或所述测序是在一个或多个与所述微流体装置流体联通的独立的流体装置中进行的。22.如权利要求18所述的方法，其中，所述的导入、去除、加热以及回收均是自动化进行的。23.表1-8中所识别出的核酸适体，除SEQID NOS : ，70，和81这几个核酸适体以外。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·G·克莱格海德，
申请(专利权)人：康奈尔大学，
类型：发明
国别省市：US