高容量固相制造技术

本发明专利技术涉及用于生物亲和性测定和其它固相应用的高容量固相，其使用分析物－特异性生物分子，在两性离子添加剂的存在下，通过包被固体载体制备得到。根据本发明专利技术制备的结构提供了具有增强的结合性质的高容量固相，其有利于任何基于固相的测定。本发明专利技术还涉及所述固相的用途及其制备方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高容量固相本专利技术涉及用于生物亲和性测定和其它固相应用的高容量固相。本专利技术还涉及该 高容量固相的用途及其制备方法。固相生物亲和性测定根据将抗体或其它生物分子吸附在固体载体上，例如在球形 颗粒的外表面，或在试管、微量滴定孔的内表面或平面“芯片”表面，其然后用于固定第二个 捕捉分子或待测的分析物。现在，已知许多不同的包被技术用于制备固相应用的功能性活性表面。然而，当前 对测定灵敏度、动力学和耐用(robustness)的期望提出了对于关键测定成分的新要求，例 如固相性质。现有的模型表面常常不能满足对于测定性能和更高表面结合容量的要求。产生固相包被的最简单方法是在固体载体上吸附未修饰的蛋白质，所述固体载体 常常由聚苯乙烯、聚丙烯或一些其它塑料材料或玻璃制成。将蛋白质溶解于缓冲液，例如碳 酸盐或磷酸盐缓冲液，然后施加在固体载体的表面。所述包被在湿润的环境下进行，然后利 用饱和步骤阻断非特异性结合位点，最后干燥表面。然而，由于常常仅有小部分天然蛋白质 在该被动吸附后保留其活性，因此在结合容量方面，以此方法获得的固相包被常常不是最 佳选择。因此，多项研究寻求改善蛋白质包被的吸附性质和表面稳定性，例如蛋白质在吸 附在固体载体前偶合至不同的"载体"蛋白质。常常需要修饰大分子的天然结构以产生改 善的吸附性质，满足测得的需求。一种此类大分子为链亲和素，其广泛用于捕捉生物素化的蛋白质至固相上。已经 在许多基于固相的应用包括微阵列、生物传感器和其它生物亲和性测定中应用链亲和素紧 密结合生物素的基本性质。US 5，061，640A描述了较大前体蛋白质增强链亲和素的吸附性的用途。所述方法 提供了包被方法，其通过将链亲和素连接至更疏水的载体分子如牛血清白蛋白上，然后包 被在疏水固体载体上改善链亲和素在固体载体上的附着，因此得到具有改善结合性质的固 相。改善被包被物质的吸附性质的另一方法描述在US 6, 638, 728B1中，其描述了单 体链亲和素与双功能交联剂的聚合，以提供链亲和素的二聚体、三聚体和四聚体的混合物， 当吸附在聚苯乙烯上时，其比天然的链亲和素表面具有改善的生物素结合容量。巯基化的(thiolated)链亲和素经二硫基(disulphide groups)的聚合也已 经显示提供了固相性质的改善，当被包被在聚苯乙烯表面时，通过在孵育期间最小化 蛋白质从固相漏出而产生增强的表面稳定性(Valimaa , L.，Laurikainen, K.，2006 “Comparison-study of streptavidin coated microtitration plates", J. Immunol. Methods. 308,203)。然而，该研究还揭示，尽管基于巯基化的链亲和素的包被显示了优于天 然的链亲和素的固相性质和改善的结合容量，然而其它包被显示更高的吸附容量。另一方 面，所述包被趋于不稳定。实际上，固相性质高度依赖于所用的包被条件，所述条件包括应用的缓冲液组合 物和所使用的包被技术。因此，多项研究已经揭示印刷溶液中缓冲液添加剂改善点形态(spot morphology)和再现性的重要性。为了降低点形态之间的差异和改善点产物(spot production)的总体再现性，常常使用不同的表面活性剂。因此，对于US 2006/0223074A1，已经提出了用于包被固体载体的点样溶液 (spotting solution)，其包括亚烷基二醇、甜菜碱、洗涤剂和盐。甜菜碱具有两性离子结 构，而在US 2006/0223074中公开的洗涤剂为离子型或非离子型。该组合物提供了高度的 点一致性(spot consistency)和稳定性，以及便于生产和长期保存。其它研究报道了多项关于DNA-微阵列的优化的缓冲液组合物。然而，尽管这些研 究报道了当使用甜菜碱作为点样溶液的添加剂时，比不含添加剂的常规点样溶液信号强度 有所改善，但是此类包被得到较小的总结合容量。因此尚存在为固体载体提供固相包被的要求，其中所述固相展示高结合容量却不 降低稳定性性质。因此本专利技术的一个目的是提供此类高容量固相，其可用作高效应用如微阵列、生 物传感器和其它生物亲和性测定。因此本专利技术的第一个方面涉及高容量固相，其利用包括以下依次步骤的方法制 备a)在两性离子添加剂的存在下，用分析物-特异性生物分子包被固体载体，其中 所述的生物分子包含SH-基团，b)孵育固体载体充足时间，以将所述生物分子固定至所述固体载体，以及c)干燥所述固体载体。在上下文中，此处所用的术语“高容量固相”是指任何适合生物测定的合适固相。此外，在上下文中，此处所用的术语“固体载体”是指任何适合被上述高容量固相 包被的合适固体载体。典型地，此类固体载体可为聚苯乙烯、聚丙烯或一些其它塑料材料或 玻璃。此处所用的术语“分析物-特异性生物分子”是指任何对分析物具有特异性结合 能力的生物分子。应理解，所述生物分子可通过直接结合对分析物特异，例如使用抗体作为 生物分子特异性地结合至分析物。或者所述生物分子可间接结合至分析物，例如使用链亲 和素作为生物分子结合连接在待测分析物上的生物素部分。根据本专利技术应理解，生物分子包含的SH-基团可存在于所用生物分子的天然结构 中，例如以生物分子中还原的二硫键的形式，或者其可通过化学修饰在天然的蛋白质结构 中产生。此处所用的术语“两性离子添加剂”是指任何电中性的却在不同的原子上携带正 负电荷的极性化合物。两性离子添加剂的实施例为甜菜碱和磷酰胆碱。对于本专利技术的高容量固相，提供了具有惊人增强结合性质的固相。因此，惊人地观 察到，使用根据本专利技术的新颖的包被缓冲液(即包含两性离子添加剂以及含SH-基团的生 物分子)包被固相，当以干包被技术(dry coating technique)使用该包被溶液时，比常规 的包被提供了高度增加的结合活性。因此本包被惊人地提供被包被物质高度增强的吸附性 质(改善高达100倍)，并因此使得能够制备具有高容量结合性质的高密度固相。除此之外，改善的点形态视为获得的固相的高度稳定性。利用以下方法获得根据本专利技术的固相，将所述包被在第一次孵育中干燥，即在饱和步骤之前。该包被技术即为“干包被”。干包被使得容易进行的快速包被方法成为可能， 且较于常规的包被操作缩短了包被方法所需的总时间。干包被可以反过来以常规的点包被 方法(例如点分配和固体针印刷)以及其它印刷方法(例如喷墨印刷)应用。在本专利技术的一些实施方式中，根据本专利技术的高容量固相利用进一步包括使用非相 互作用成分饱和固体载体上的非特异性结合位点的步骤制备。此处所用的术语“非相互作用成分”是指不与根据本专利技术使用的生物分子或分析 物发生特异性相互作用的有机化合物或第二种生物分子，即所述非相互作用成分仅结合在 非特异性结合位点上。典型地，该非相互作用成分为惰性蛋白质，例如牛血清白蛋白，其将 结合在固体载体的非特异性结合位点上。而且，非相互作用成分可结合在固相的非特异性 蛋白质位点上。因此，特异性与非特异性结合的信噪比得以改善，且制得的检测系统对所检 测的分析物更灵敏。根据本专利技术的分析物-特异性生物分子可选自蛋白质、抗体、抗体片段、抗原、受 体配体、蛋白质受体、特异性结合蛋白质、适体、核酸、寡核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用包括以下依次步骤的方法制备的高容量固相：ａ）在两性离子添加剂的存在下，用分析物－特异性生物分子包被固体载体，其中所述的生物分子包含ＳＨ－基团，ｂ）孵育固体载体充足时间，以将所述生物分子固定至所述固体载体，以及ｃ）干燥所述固体载体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰伊利科蒂拉，
申请(专利权)人：雷迪奥米特医学公司，
类型：发明
国别省市：DK