本发明专利技术公开提供了通过使用夹心ＥＬＩＳＡ测试捕获、检测、表征和定量少量人体液中人外来体的方法。该方法允许对外来体制备物进行完全表征，因此提供了通过使用非侵入性测定区分疾病相关状况与健康状态的工具。事实上，该方法可用于使用简单血浆样品进行的肿瘤筛选、诊断和预后。同时，循环外来体的测定可以提供有关患者中存在的肿瘤水平的信息。本文提供的方法适合于评价在循环外来体中是否存在一些传染性和／或传播性试剂，如病毒蛋白或朊病毒蛋白。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术大体上涉及癌症诊断领域。更具体地，本专利技术涉及定量和定性人体液中外来体(exosomes)的方法。
技术介绍
外来体是大小介于30-120nm之间的微泡，其通过通常用于受体释放和细胞间相互通信的胞吐途径活跃地分泌。在多步超速离心后，可以在细胞培养上清液和一些体液中检测到外来体。除了主要组织相容性复合体蛋白(MHC I、MHC II)以及参与抗原呈递的蛋白之外，外来体可能携带参与多种细胞功能的膜蛋白和胞质蛋白。在特定生理条件下，从不同细胞类型分泌外来体，所述细胞类型如树突状细胞(DC)、淋巴细胞、肥大细胞和上皮细胞。该过程导致形成了篮样细胞贮器，其含有也称为多泡体(MVB)的这些多融合源微泡。已通过超结构观察分辨了该过程，特别是在正常细胞中。但是，通过外来体制备物的免疫电子显微镜和蛋白质印迹分析已表明这些微泡共表达了不同胞内液泡的标志物，如早期内涵体 (例如，Rab5)、溶酶体(例如CD63、CD81、LAMP-1)和晚期吞噬体(Rab7)，以及其它一些细胞特异性更强的蛋白(例如MHC III类抗原)。从肿瘤细胞释放的外来体明显多于从正常细胞释放的外来体，并且它通常与免疫抑制作用有关。除了一些肿瘤标记物(如，结肠癌的CEA、黑素瘤的MART-I或gp-100)的表达外，肿瘤来源的外来体在多个方面与正常细胞的外来体可比较。此外，似乎肿瘤外来体的来源在多个方面是与正常外来体不相似的。这可能是由于恶性细胞从细胞质到胞外环境的囊泡运输更有活力所造成的，反之亦然。肿瘤外来体在癌症发展中的作用是最近出现的研究领域。初始数据表明这些细胞器起到DC介导的T细胞交叉激活的肿瘤抗原性材料载体的作用。这些结果支持了使用肿瘤外来体作为抗癌疫苗的临床尝试。越来越多的有关这些微泡对免疫系统不同组件所施加的一大批抑制作用的证据明确支持肿瘤外来体参与了疾病发展。特别地，最近表明由各种来源的人肿瘤细胞分泌的外来体能够通过死亡配体(例如i^asL、TRAIL)的表达在激活的T 细胞中引起细胞凋亡，并且能够抑制NK功能和促使从正常单核细胞生成骨髓源抑制细胞。 这些数据连同肿瘤可能来源的外来体可以在癌症患者的血浆和肿瘤渗漏中大量存在这一可复现证据支持了肿瘤外来体在影响宿主微环境以允许肿瘤细胞生长和发展中的作用。考虑到对外来体在癌症发展中的作用理解的深入以及对发现新治疗、改善对肿瘤恶性程度以及生长的诊断和随访的需求不断提高的这一事实，因此需要检测和测定人体液中外来体的方法和工具。然而，事实上目前用于检测外来体的方法不是非定量的(TEM)，就是定量性较差(WB)。尽管流式细胞术已用于定量外来体，但该方法不能进行研究人员需要的精确测定。事实上，虽然FACS (荧光激活细胞分选法)分析是定量细胞(即使是小尺寸细胞)的合适方法，但是它不适合于对这些小囊泡(即50-100nm)的量进行定量。此外，总平均荧光的粗略测定不能对给定样品中存在的微泡数量进行精确定量。此外，FACS分析不允许同时分析不同的样品。因此，需要对来自少量体液的外来体进行检测和定量的方法。此外，考虑到癌症早期诊断对疾病治疗至关重要这一事实，需要潜在的肿瘤标志物和预后因子。专利技术简述获得有关外来体的有用体内数据的主要问题为从人体液(特别是从血浆)获得外来体以对其进行定量和表征的目前可用方法的效率水平较低。所述体液也可以是腹水、脑脊液、骨髓、尿液、粪便或支气管肺泡洗液。为了提供目前所面临的这些问题的解决方案，本专利技术公开提供了对来自体液(特别是来自人血浆)的外来体进行检测和定量的简单可靠的方法。根据本专利技术公开，基于ELISA的检测(称为hoTest)允许对来自健康供体和肿瘤患者人血浆的外来体进行定量和表征。通过该测试，有可能对来自移入人黑素瘤或结肠癌细胞的SCID小鼠以及肿瘤患者的血浆的外来体样微泡进行表征。本专利技术公开显示血浆外来体水平与肿瘤大小直接相关，并且仅在从肿瘤患者血浆纯化的外来体中可检测到窖蛋白-1。根据本专利技术公开，人患者血浆中肿瘤外来体的检测在人恶性肿瘤的诊断和随访中是有用的。本文公开的技术允许进行在肿瘤诊断、随访和筛选的临床实践中有用的非侵入性测试。根据本专利技术公开所述的技术还在肿瘤的临床研究中有用。此外，正如已知可以在细胞释放的外来体内或在血浆中检测到一些病毒(例如，HIV和HCV)以及朊病毒，本专利技术公开所述的技术还可以用于表征和研究其它疾病，如病毒、传播性和自身免疫性疾病。此外， 基于在外来体上表达的蛋白(例如，肿瘤标志物、病毒蛋白、朊病毒蛋白)，本专利技术提供了改善现有临床测试的工具。本专利技术的原理基于两个要点1.先前技术中没有使得能够对外来体进行定量和表征的方法，特别是对通常在人血浆样品中获得的少量外来体。2.在多种人类疾病状况(特别是癌症)中对非侵入性诊断和/或预后测试尚未满足的需求。因此，本专利技术的目标是提供定量和表征外来体的方法，特别是定量和表征少量(in small volumes)夕卜来体的方法。本专利技术的另一个目标是提供定量和表征血浆样品中外来体的方法。本专利技术的另一个目标是提供测定少于2ml的体液中外来体水平以及对外来体的蛋白组成进行基本完全表征的方法。此外，本专利技术的目标是提供同时定量几个样品中外来体的方法。另外，根据本专利技术公开所述的测试表明血浆中外来体的数量与肿瘤大小有关。因此，本专利技术的另一个目标是提供随访以及提供癌症患者预后的方法。此外，本专利技术的目标是提供测试以建立血浆外来体的细胞来源并评价其中是否存在一些传染性(HIV、HCV)和/或传播性(transmissible)试剂(例如，朊病毒蛋白)。附图说明图1.从人黑素瘤细胞培养物上清液中纯化的外来体的检测。A.用于外来体检测和定量的Ex0Test(ELISA)装置示意图。B.通过ExoTest对纯化的⑶63+外来体进行剂量递增分析。初始浓度相当于50 μ g外来体，并且将外来体以2倍稀加入。C.在从人黑素瘤细胞(Me501)培养上清液纯化的不同量的外来体中的⑶63、 Rab5b和Lamp-I表达的蛋白质印迹分析。D.在从Me501细胞上清液纯化并涂覆至乳胶珠的黑素瘤来源的外来体中的Ral^b 和⑶63表达的FACS分析。图2.移入人黑素瘤的SCID小鼠的血浆外来体的检测。A.通过ExoTest对从移入人黑素瘤细胞的SCID小鼠的血浆中纯化的肿瘤外来体进行的剂量递增分析。B.在从移入人黑素瘤细胞(Me501)的SCID小鼠血浆纯化的外来体中进行的 Rab-5b和CD63表达的FACS分析。C.在肿瘤生长的不同时间分析的移入Me501的SCID小鼠中的血浆外来体水平与肿瘤大小的相关性。每个时间点用5只动物表示小鼠组。外来体水平表示为0D450X1000。图3.外来体中窖蛋白-1 (Cav-I)表达的表征A.人黑素瘤细胞和巨噬细胞的细胞提取物和外来体中Cav-I的蛋白质印迹分析。B.从Me501细胞、移入Me501的SCID小鼠血浆以及肿瘤阴性SCID小鼠血浆纯化的外来体中⑶64、Rab-5b和Cav-I的蛋白质印迹分析。C.从移入了 Me501的SCID小鼠血浆纯化的外来体中Cav-Ι表达的FACS分析。D.来自携带黑素瘤并在移入后5周处死的SCID小鼠的⑶63+和Cavl+外来体的血浆水平。图4.本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．定量和定性人细胞源样品中或体液中外来体的方法，所述方法包括以下步骤：ａ）从所述人细胞源样品或体液纯化外来体制备物；ｂ）用一抗捕获所述纯化的外来体制备物中的外来体；ｃ）用检测抗体检测结合的外来体；ｄ）使酶联二抗与所述检测抗体反应；ｅ）加入底物；和ｆ）检测所述反应。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·法伊斯，
申请(专利权)人：汉萨生物医药公司，
类型：发明
国别省市：EE
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