疾病相关基因的多态性检测用探针及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种对于Ｋ－ｒａｓ基因能够简便且以优异的可靠性判别不同多态性的多态性检测用探针及其用途。将包含下述（Ｐ１）、（Ｐ２）、（Ｐ３）、（Ｐ１’）、（Ｐ２’）和（Ｐ３’）中的至少任意一种寡核苷酸的探针作为疾病相关基因Ｋ－ｒａｓ基因的多态性检测用探针。（Ｐ１）碱基长度为１１～５０个碱基，由与包含序列编号１中碱基序号２２０～２３０的碱基序列互补的碱基序列构成，且在５’末端区域具有与上述碱基序号２３０的碱基互补的碱基的寡核苷酸；（Ｐ１’）由与上述（Ｐ１）的寡核苷酸互补的碱基序列构成的寡核苷酸；（Ｐ２）碱基长度为１５～５０个碱基，由与包含序列编号１中碱基序号２２０～２３４的碱基序列互补的碱基序列构成，且在５’末端区域具有与上述碱基序列２３４的碱基互补的碱基的寡核苷酸；（Ｐ２’）由与上述（Ｐ２）的寡核苷酸互补的碱基序列构成的寡核苷酸；（Ｐ３）碱基长度为１７～５０个碱基，由与包含序列编号１中碱基序号２２０～２３６的碱基序列互补的碱基序列构成，且在５’末端区域具有与上述碱基序列２３６的碱基互补的碱基的寡核苷酸；（Ｐ３’）由与上述（Ｐ３）的寡核苷酸互补的碱基序列构成的寡核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于检测疾病相关基因的多态性的探针及其用途。
技术介绍
RAS蛋白质和RAF蛋白质是形成通过RAS/RAF/MAH(通路的细胞内信号转导的级联反应的蛋白质。上述RAS/RAF/MAPK通路，RAF蛋白质被活性型RAS蛋白质活化，MEK蛋白质被活性型RAF蛋白质活化，进而MAHi蛋白质被活性型MEK蛋白质活化。由此调节细胞的增殖和分化等。作为上述RAS蛋白质的一种的K-Ras蛋白质，是具有GTP酶活性的⑶P/GTP结合蛋白质，在人体中，由位于第12染色体上的K-ras基因编码。已知上述K_ras基因在密码子12、密码子13等中突变(非专利文献1 3等)。密码子12的突变有，在序列编号1的 K-ras基因的部分序列中，序列编号220的碱基(η)从鸟嘌呤(g)取代为腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)，序列编号221的碱基(η)从鸟嘌呤(g)取代为腺嘌呤(a)、胞嘧啶 (c)或胸腺嘧啶(t)。密码子13的突变有，在序列编号1的K-ras基因的碱基序列中，序列编号223的碱基(k)从鸟嘌呤(g)取代为胸腺嘧啶(t)，序列编号2M的碱基(r)从鸟嘌呤 (g)取代为腺嘌呤(a)。通过上述密码子12的突变，K-ras蛋白质的第12位的甘氨酸(G) 突变为丝氨酸(S)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、天冬酰胺(N)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)。通过上述密码子13的突变，K-ras蛋白质的第13位的甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)。有报告K-ras基因的密码子12或密码子13的突变与例如大肠癌、胰腺癌等癌症、CFC(cardio-facio-cutaneous)等先天性疾病相关，与对于抗EGFR抗体药物的耐药性相关(非专利文献1 3等)。因此，在K-ras基因中，这些突变的有无，即多态性的检测，例如，对于上述疾病的诊断、更有效的疾病治疗方法的选择等至关重要。此外，作为上述RAF蛋白质的一种的BRAF蛋白质是具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白质，在人体中，由位于第7染色体上的BRAF基因编码。有报告上述BRAF基因的突变也与上述K-ras基因相同，与上述癌症和先天性疾病相关，与耐药性相关(非专利文献1 3等)。上述BRAF基因的突变已知在序列编号2的BRAF基因的部分序列中碱基序号2 的碱基(w)从胸腺嘧啶(t)取代为腺嘌呤(a)。当上述碱基为野生型(t)时，BRAF蛋白质的第600位的氨基酸为缬氨酸(V)，当上述碱基为突变型(a)时，BRAF蛋白质的第600位的氨基酸为谷氨酸(E)。据认为通过该氨基酸残基的突变，就可以获得肿瘤原性。因此，除了上述K-ras基因以外，通过检测上述BRAF基因突变的有无，即多态性，就能够进一步提高例如上述疾病的诊断以及选择更有效的疾病治疗方法等的精度。另一方面，检测基因的多态性的方法报告了各种方法，例如，可以列举 PCR(Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应)-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 限制性片段长度多态性)法等。上述PCR-RFLP法是对于试样的靶DNA，通过PCR扩增检测目的区域，以限制性内切酶处理该扩增产物，通过DNA杂交(Southern Hybridization)印迹由多态性造成的内切酶片段长度的变化的方法。如果基因中存在目的突变，则限制性内切酶的识别部位消失，所以通过切断的有无，即，限制性片段长度的变化，就能够检测突变的有无。然而，上述PCR-RFLP法，例如，在PCR后，需要用各种限制性内切酶处理所得到的扩增产物并进行分析，很费时间。另外，所得到的扩增产物的限制性内切酶处理，需要暂时将扩增产物取出再进行。因此，有第一次反应所得到的扩增产物飞溅而混入到第二次的其他反应中的危险。由于这样的问题，所以难以自动化进行多态性的检测。由于这样的问题，近年来，作为多态性的检测方法，Tm (Melting Temperature)分析备受关注。该方法如下首先使用与含有检测目的多态性的区域互补的探针，形成被检测核酸与上述探针的杂交体(双链核酸)；然后，对所得到的杂交体实施加热处理，通过吸光度等的信号测定检测出随着温度上升上述杂交体向单链核酸的解离(熔解)。通过基于该检测结果决定Tm值来判断多态性。杂交体中两个单链核酸的互补性越高Tm值越高，互补性越低Tm值越低。这里，当检测对象部位的多态性为X或Y时，通过含有目的多态性(例如，Y)的核酸和与其100%互补的探针杂交，预先求出Tm值(评价标准值)；接着，测定上述被检测核酸和上述探针的Tm值(测定值)；这样，该测定值如果与上述评价标准值相同， 则上述被检测核酸和上述探针为完全匹配(perfect match)，S卩，能够判断上述被检测核酸的检测对象部位为目的多态性(Y)。另一方面，上述测定值比上述评价标准值低时，上述被检测核酸和上述探针不匹配(mismatch)。即，能够判断上述被检测核酸的检测对象部位为另一方的多态性(X)。根据这样的方法，例如，能够仅通过对添加有上述探针的PCR反应液实施温度处理并进行信号测定来检测多态性。因此，检测装置的自动化也成为可能。然而，这种利用Tm分析的检测方法，例如，必须通过Tm值来判断一个碱基的不同。 另外，在基因具有多种多态性的情况下，即使分析一个样品也要伴随大量的工作量。因此， 分析大量的样品时也存在不能实用的问题。因此，特别是需要即使在野生型的多态性和大量突变型的多态性混合存在的情况等也可以准确地检测突变的有无。现有技术文献非专利文献非专利文献1 =Cancer Epidemiology Biomarkers，2000 年 11 月，ρ· 1193-1197非专利文献2 J Mol Diagn.，2006 年 11 月，Vol. 8，No. 5，p. 540-543非专利文献3 :J Natl Cancer Inst.，2009 年 10 月 7 日，Vol. 101，No. 19， ρ· 1308-1324 (Epub :2009 年 9 月 8 日)
技术实现思路
专利技术所要解决的课题出于这样的原因，K-ras基因的多态性的检测在例如上述疾病的诊断和治疗方法的选择中非常重要。因此，本专利技术的目的在于提供一种对于疾病相关基因κ-ras基因可以简便且以优异的可靠性判别多态性的多态性检测用探针及其用途。用于解决课题的方法为了达到上述目的，本专利技术的多态性检测用探针是用于检测疾病相关基因K-ras 基因的多态性的探针，其特征在于，包含下述(PI)、(P2)、(P3)、(P1，)、(P2，)和(P3，)中的至少任意一个寡核苷酸。(Pl)碱基长度为11 50个碱基，由与包含序列编号1中碱基序号220 230的碱基序列互补的碱基序列构成，且在5’末端区域具有与上述碱基序号230的碱基互补的碱基的寡核苷酸；(Pl')由与上述(Pl)的寡核苷酸互补的碱基序列构成的寡核苷酸；(P2)碱基长度为15 50个碱基，由与包含序列编号1中碱基序号220 234的碱基序列互补的碱基序列构成，且在5’末端区域具有与上述碱基序列234的碱基互补的碱基的寡核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种疾病相关基因Ｋ－ｒａｓ基因的多态性检测用探针，其特征在于，包含下述（Ｐ１）、（Ｐ２）、（Ｐ３）、（Ｐ１’）、（Ｐ２’）和（Ｐ３’）中的至少任意一种寡核苷酸：（Ｐ１）碱基长度为１１～５０个碱基，由与包含序列编号１中碱基序号２２０～２３０的碱基序列互补的碱基序列构成，且在５’末端区域具有与所述碱基序号２３０的碱基互补的碱基的寡核苷酸；（Ｐ１’）由与所述（Ｐ１）的寡核苷酸互补的碱基序列构成的寡核苷酸；（Ｐ２）碱基长度为１５～５０个碱基，由与包含序列编号１中碱基序号２２０～２３４的碱基序列互补的碱基序列构成，且在５’末端区域具有与所述碱基序列２３４的碱基互补的碱基的寡核苷酸；（Ｐ２’）由与所述（Ｐ２）的寡核苷酸互补的碱基序列构成的寡核苷酸；（Ｐ３）碱基长度为１７～５０个碱基，由与包含序列编号１中碱基序号２２０～２３６的碱基序列互补的碱基序列构成，且在５’末端区域具有与所述碱基序列２３６的碱基互补的碱基的寡核苷酸；（Ｐ３’）由与所述（Ｐ３）的寡核苷酸互补的碱基序列构成的寡核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：细见敏也，
申请(专利权)人：爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：JP