存储寿命长的高性能电泳凝胶制造技术

本发明专利技术制作了用作电泳介质的聚丙烯酰胺凝胶，其具有高分辨率和对储存期间水解作用的高抗性，所述凝胶包含作为两性电解质的牛磺酸、天冬酰胺或上述两者和作为缓冲剂的三（羟甲基）氨基甲烷或二（２－羟乙基）氨基－三羟甲基甲烷，以及其它常规组分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及聚丙烯酰胺电泳和用于此类电泳的聚丙烯酰胺凝胶电泳。2.现有技术聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)之所以在研究和诊断以及生物化学实验领域被广泛应用，主要是因为聚丙烯酰胺凝胶的透光性和电中性，还因其对凝胶分离物质分子量广谱的灵活性和适应性。这种灵活性来自制造者控制凝胶孔隙度的能力，这种控制是通过改变丙烯酰胺单体的浓度和双丙烯酰胺交联剂与丙烯酰胺单体之比。PAGE尤其适合十二烷基硫酸钠(SDS)存在下的蛋白质分离，其中，SDS可以含于凝胶中，也可以含于电泳缓冲液中。 常用缓冲剂是三羟甲基氨基甲烷(〃 Tris")和二(2-羟乙基)氨基-三羟甲基甲烷(〃 双-Tris")。知名蛋白质分离用聚丙烯酰胺凝胶之一是最早Laemmli所述的凝胶(U.K.， 自然(Nature) 227 :680 (1970))，它含有Tris-HCl缓冲液，ρΗ8· 8。然而，ρΗ如此之高的凝胶易随时间而水解，即便冷藏亦是如此。水解会造成凝胶内各蛋白质迁移距离缩短，蛋白质条带分辨率降低。如果为了避免水解而降低ΡΗ，则会对凝胶内分离蛋白质分辨率的锐利度造成一定程度的损失，并且，常常还会丧失有效分析蛋白质化合物的能力。解决这一问题的方法之一是在凝胶中加三乙醇胺，如本申请人的同时在审美国专利申请12/552，104(申请日2009年9月1日)所述。本专利技术则提供另一种方法。
技术实现思路
目前发现即便长期储存也能抗水解，并且能在电泳条件下将蛋白质分离和拆分为清晰条带的聚丙烯酰胺凝胶是含有两性电解质的那些，所述两性电解质为牛磺酸、天冬酰胺或牛磺酸与天冬酰胺的混合物。还发现含牛磺酸、天冬酰胺或上述两者的预混成凝胶溶液可长期储存，然后加入聚合催化剂形成凝胶，所得凝胶上的蛋白质分离其分辨率没有明显下降，尽管所述溶液经历了长期储存。所述预混溶液含有单体和交联剂，以及可选的用于形成产物凝胶的缓冲剂及其它组分，但是，该溶液不含任何聚合催化剂。此外，不论是经储存的凝胶还是经储存的预混成凝胶溶液都都含有电泳凝胶常用的缓冲液，主要的例子是Tris和双-Tris缓冲液。本专利技术某些凝胶和预混溶液中还含有一种常规两性电解质， 例如甘氨酸和tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)，与牛磺酸或天冬酰胺构成联合两性电解质。某些实施方式中还包含可选的其它组分，诸如稳定剂、PH调节剂、条带锐化剂和其它缓冲剂。当预成形和储存备用时，本专利技术凝胶的优点之一是存储寿命长，即能够抵抗储存期间的水解作用。本专利技术凝胶的优点还包括，与其它组成的凝胶相比，蛋白质拆分带更锐5利，不论凝胶在用前是否经历储存，是否用经储存的溶液制备，还是当天即配即用或即制即用。本专利技术的优点还在于本专利技术凝胶在近中性PH锐利拆分蛋白质的能力。本专利技术的优点还在于本专利技术凝胶在高电压下锐利拆分蛋白质的能力和相应缩短分离时间的能力。本专利技术凝胶尤其适合高浓度均勻(非梯度)凝胶和最高浓度较高的梯度凝胶。专利技术人所谓“本专利技术凝胶在长期储存中能抗水解”或“预混成凝胶溶液经长期储存后能够制成抗水解凝胶”是指，如后文所示，尽管经历储存，所得凝胶保留了提供分析用蛋白质电泳分离的能力。体现本专利技术优点的存储期超过1天，优选3天或以上，更优选7天或以上，更优选1个月或以上，更优选6个月或以上，甚至可长达一年。储存条件一如预成形电泳凝胶储存常用的那样。这通常包括10°C以下冷藏，或约1-10°C冷藏，通常为4°C左右冷藏。本专利技术适用于任何尺寸和形状的凝胶，包括管状和板状凝胶，以及积层凝胶与拆分凝胶的组合。以下将详细阐述本专利技术的上述及其它特征、目的和优点。 具体实施例方式本专利技术聚丙烯酰胺凝胶是按照本领域熟知的方法，由丙烯酰胺单体和丙烯酰胺交联剂在聚合催化剂存在下聚合而成的。“丙烯酰胺交联剂”指这样一种分子，其在丙烯酰胺单体聚合过程中与丙烯酰胺单体反应从而形成交联。可采用本领域已知的丙烯酰胺交联剂，广泛使用的知名丙烯酰胺交联剂之一是N，N'-亚甲基-双丙烯酰胺，亦称“双丙烯酰胺”或简称为“bis. ”。其它丙烯酰胺交联剂有二丙烯酸乙二醇酯(ED)、二烯丙基酒石酸二酰胺(DATD)和二羟基亚乙基双丙烯酰胺(DHEBA)。本专利技术适合孔隙度范围广泛的多种聚丙烯酰胺凝胶，然而，如前所述，特别适用于高浓度因而低孔隙度的凝胶或具有多个不同高浓度区域的凝胶(例如梯度凝胶)。根据本领域常规用途，全部单体(即丙烯酰胺加交联剂)的总浓度以重量百分比表示，并以符号T 指代，交联剂与单体总量之比也以重量百分比表示，并以符号C指代。T值和C值对本专利技术来说至关重要，但在大多数应用中，T的范围约为4%至25%，优选约8%至约15%，C的范围约为2%至10%，优选约2. 5%至约5%。本专利技术优选的高浓度凝胶中，T的范围约为12% 至20%。对于均勻浓度凝胶来说，T值优选约15%至约18%，对梯度凝胶来说，T值的上限优选约15%至约25%，最优约20%。对梯度凝胶来说，T值通常有由一最低浓度(约4%) 升至一最高浓度(约12%至约20%)。常见的例子中，梯度凝胶的T值由4%升至12%，或由4%升至15%，或由4%升至20%，同时，优选C值如前所述。促进所述单体聚合形成凝胶的本领域已知催化剂有例如过硫酸铵(APS)，N，N'-四亚甲基乙二胺(TEMED)，核黄素和 β - 二甲氨基丙腈，它们都按催化有效量使用，各自的催化有效量对本领域技术人员来说是显而易见的。典型的催化剂浓度之一是每毫升(mL)凝胶溶液0. 3-3. 0 μ g，而常见的例子之一是APS加TEMED组合，各自的浓度在该范围内。如前所述，如果是制成凝胶前需长期储存的预混溶液，加入一种或多种催化剂的时间点为适用者即将制作凝胶的时候，通常是临近凝胶使用之前或在使用当天。凝胶和预混溶液中牛磺酸或天冬酰胺的浓度没有限定，但多数情况下，浓度约 100-300mM、优选约150_250mM时可获得最佳结果。牛磺酸与天冬酰胺之间，优选的是牛磺酸。如有甘氨酸或Tricine，其浓度也没有限定，但多数情况下，甘氨酸或Tricine浓度约为50-200mM、优选约100-150mM时可获得最佳结果。牛磺酸(或天冬酰胺)与甘氨酸(或 Tricine)浓度之比以大于1.0为佳，最好约为1. 25至2. 0。同样，Tris或双-Tris的浓度也没有限定，但多数情况下，约50mM至约200mM可获得最佳结果。典型的现有技术聚丙烯酰胺凝胶制备物中，单体溶液的PH可用合适的酸调节到所需范围，此类酸的例子有盐酸、 硫酸、乙酸、硼酸、磷酸和羟基乙酸。根据需要，可将PH调至6. 4-9.0。优选中性范围例如 6. 4-7.0的pH。现在认为，本专利技术的最佳实施方式是含有75mM 1Tris-HCldOOmM牛磺酸、 125mM甘氨酸、23mM HCl和各类单体T值为4_12、4_15%或4-20% T、C = 2. 6%的梯度凝胶。某些实施方式中，用于形成凝胶的溶液和用到预混溶液的本专利技术实施方式中的预混溶液还包含一种弱酸或两种或更多种弱酸的组合。所述弱酸的例子有柠檬酸、马来酸、磷酸、乙酸和硼酸。优选柠檬酸和马来酸，最好是柠檬酸。如果存在弱酸，其浓度优选约 0. 01mol/L(10mM)至约 0. 50mol/L(500mM)，最优约为 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．聚丙烯酰胺凝胶，包含：交联的聚丙烯酰胺、选自三（羟甲基）氨基甲烷和二（２－羟乙基）氨基－三（羟甲基）甲烷的缓冲剂和选自牛磺酸和天冬酰胺的两性电解质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·彼得森，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US