一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法。该方法包括：将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术对DNA片段进行分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8～2.5s，终末转换时间为8～10s。本发明专利技术脉冲场凝胶电泳分型方法可对乳源革兰氏阳性菌进行准确分型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法。
技术介绍
脉冲场凝胶电泳(PFGE，PulsedFieldGelElectrophoresis)是一种分离大分子DNA的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子(>10kb)移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向(有一定夹角，而不是相反的两个方向)变动。DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。现今，PFGE作为一种基因分型技术得到广泛的应用。目前，较多关于PFGE的应用集中在致病菌基因分型以及溯源方面，而从已有的报道看出这些致病菌大多为革兰氏阴性菌，鲜有关于PFGE在革兰氏阳性菌应用中的报道。革兰氏阳性菌大部分为耐热芽孢杆菌，这些耐热芽孢杆菌在食品尤其是乳制品生产中会造成重大损失。主要在乳制品企业生产中表现在耐受传统的巴氏杀菌(72℃/15s)，有些甚至能耐受超高温杀菌(UHT，140-145℃/2-5s)而存活下来，对生产加工甚至最终产品有重要影响。例如，枯草芽孢杆菌对特殊菌体进行促芽孢和微胶囊包被处理，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60℃高温，在120℃温度下能存活20分钟。目前，适合于革兰氏阴性菌的PFGE技术无法对革兰氏阳性菌进行准确的基因分型，PFGE在乳源革兰氏阳性菌研究尚未有研究。因此，开展乳源革兰氏阳性菌PFGE研究应用一方面能为这类菌进行基因分型；另一方面能进行溯源研究，控制耐热芽孢菌对生产加工和产品影响，减少企业损失。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法。该脉冲场凝胶电泳分型方法可对乳源革兰氏阳性菌进行准确分型。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法，包括如下步骤：将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术对DNA片段进行分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8～2.5s，终末转换时间为8～10s。在本专利技术提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳技术的初始转换时间为2.2s，终末转换时间为10s。作为优选，脉冲场凝胶电泳的梯度电压为5～7V/cm，电泳液温度为12～16℃，电压角度为100°～120°，初始电流为140～170mA。在本专利技术提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳技术的梯度电压为6V/cm，电泳液温度为14℃，电压角度为120°，初始电流为170mA。作为优选，脉冲场凝胶电泳的运行时间为15～16h。在本专利技术提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳运行时间为15h。作为优选，裂解采用的裂解液为细胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。作为优选，以mL/mg/mg计，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为5：(1～3)：(7～9)。优选地，以mL/mg/mg计，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为5：2：8。作为优选，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的体积比为(40～60)：4，乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的OD值为4～5。优选地，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的体积比为51：4，乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的OD值为4～4.5。作为优选，裂解的温度为50～55℃，时间为2～5h，转速为50～70rpm。优选地，裂解的温度为54℃，时间为4h，转速为60rpm。作为优选，DNA酶切采用的限制性内切酶为XbaI内切酶。在本专利技术提供的一些实施例中，DNA酶切的温度为37℃，时间为2～4h。作为优选，将乳源革兰氏阳性菌裂解之前还包括初步裂解的步骤，初步裂解采用的裂解液为细胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。作为优选，以mL/mg/mg计，初步裂解中，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为1：(4～6)：(18～22)。优选地，以mL/mg/mg计，初步裂解中，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为1：5：20。作为优选，初步裂解中，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的体积比为(4～6)：4，乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的OD值为4～5。优选地，初步裂解中，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的体积比为5：4，乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的OD值为4.5。作为优选，初步裂解的温度为36～38℃，时间为30～50min。优选地，初步裂解的温度为37℃，时间为30min。在本专利技术提供的一些实施例中，乳源革兰氏阳性菌为枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌中的一种或几种。在本专利技术提供的一些实施例中，乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法包括如下步骤：1、初步裂解：向400μL乳源革兰氏阳性菌的菌悬液中加入：细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，以体积：OD计，细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分别为400μL/(4～5)、20μL/(4～5)、80μL/(4～5)，放入37℃水浴30min。2、制胶：配置1％SeakemGold:1％SDS，微波溶解，放置在55℃水浴中待用；将制得的胶与菌液混合均匀，混合时避免气泡产生，凝固，得到胶块。3、裂解：混合裂解液制备：细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，以体积：OD计，细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分别为5mL/(4～5)、20μL/(4～5)、80μL/(4～5)。胶块裂解：将胶块与混合裂解液混合，54℃水浴4h，转速60rpm。4、胶块清洗：包括DDH2O清洗、TE缓冲液清洗。5、胶块内DNA酶切：采用XbaI内切酶对胶块内DNA进行酶切，在37℃水浴中孵育2～4小时。6、电泳：配制1％SeaKemGold(SKG)胶、加样、电泳；电泳条件设置：梯度电压为6V/cm，电泳液温度为14℃，电压角度为120°，初始转换时间为2.2s，终末转换时间为10s，初始电流为170mA，运行时间为15h。7、图像处理：电泳结束后，取出胶，染色，脱色，对电泳胶块进行拍照。在本专利技术提供的另一些实施例中，乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法包括如下步骤：1、初步裂解：向400μL乳源革兰氏阳性菌的菌悬液中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，包括如下步骤：将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术对DNA片段进行分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8～2.5s，终末转换时间为8～10s。

【技术特征摘要】
1.一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，包
括如下步骤：
将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术对
DNA片段进行分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8～2.5s，终末
转换时间为8～10s。
2.根据权利要求1所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述
脉冲场凝胶电泳的梯度电压为5～7V/cm，电泳液温度为12～16℃，电压角度为
100°～120°，初始电流为140～170mA。
3.根据权利要求1或2所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，
所述脉冲场凝胶电泳的运行时间为15～16h。
4.根据权利要求1所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述
裂解采用的裂解液为细胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。
5.根据权利要求4所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，以
mL/mg/mg计，裂解液中所述细胞裂解液、所述蛋白酶K与所述溶菌酶的用
量为5：(1～3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王林林，王伟军，何光华，储小军，李海龙，
申请(专利权)人：杭州贝因美母婴营养品有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33