本发明专利技术公开了新疆小麦地方品种鉴别方法，应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术，在新疆小麦地方品种中鉴定了一个新的亚基，新的亚基命名为亚基Glu-D1(2.6+12)bp(t)，为育种材料评价和杂交后代高分子量麦谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择，提供了一种简单、准确、快速的实用方法。样品用量少，提取方法简单，无有毒试剂，分离迅速，分辨率高、检测灵敏度高等特点，但是，由于电泳图谱上亚基的迁移率与分子量并不总是一致，从而混淆分子量不同而迁移率相似的亚基，因此在精确度上有待进一步提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，属于农业
技术介绍
应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术，分析小麦品种高分子量麦谷蛋白亚基编码的Glu-Al、Glu-Bl和Glu-Dl，这种鉴定方法能将各亚基很好分离， 明确基因定位，用它的电泳图谱去鉴定小麦品质。此外，还可以利用分子标记技术、高分子量谷蛋白亚基酸性毛细管电泳(A-CE)与高低分子量谷蛋白亚基质谱(MQ等鉴定方法鉴定小麦品质。SDS-PAGE技术在品种鉴定中具有较大的应用潜力，为育种材料评价和杂交后代高分子量谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择，提供了一种简单、准确、快速的实用方法。有样品用量少，提取方法简单，无有毒试剂，分离迅速，分辨率高、检测灵敏度高等特点，但是， 由于电泳图谱上亚基的迁移率与分子量并不总是一致，从而混淆分子量不同而迁移率相似的亚基，因此在精确度上有待进一步提高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术不足提供一种。，包括以下步骤Al、麦谷蛋白的提取1)小麦种子单粒磨成细粉，称重20mg放入1.5ml的试管中，加入1. OmlSA溶液 (50%丙酮和0.8摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl pH 8. 0))，在65°C条件下培养 lh；2)离心机中于2000rpm条件下离心lmin，去上清液，重复此操作过程1次；3)加入200 μ 1的SAl溶液(在SA溶液中加入1 %甘油)，，并在涡流震荡器上混勻；4)在65°C条件下培养lh，在13000rpm条件下离心IOmin ；5)取100 μ 1的上清液，加入同样体积的SA2溶液(SA溶液中加入1. 4%乙烯基吡啶)，在65°C条件下继续培养30min后，加入0. 8ml的丙酮，在13000rpm条件下离心IOmin ；6)去上清液，沉积物在60°C条件下干燥5min，加入100 μ 1的SC溶液(20%甘油， 6摩尔尿素和25毫摩尔醋酸)；7)加入样品缓冲液十二烷基硫酸钠，62. 5毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸 (ρΗ6. 8)，10%甘油，5% 2-巯基乙醇和溴酚蓝)，混合物煮沸3min，作为SDS-PAGE分析样品保存；A2、SDS-PAGE 电泳1)麦谷蛋白通过SDS-PAGE(10%分离胶(10. 3%丙烯酰胺，1. 02%甲叉双丙烯酰胺，0.375摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6. 8)，0.2%十二烷基硫酸钠，0.033%过硫酸铵和0. 05%四甲基乙二胺的混合液)和5%的积层胶(5. 0%丙烯酰胺，0. 5%甲叉双丙烯酰胺，0. 125摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6. 8)，0.02%十二烷基硫酸钠，0.033%过硫酸铵和0. 四甲基乙二胺))分离纯化；2)聚丙烯凝胶规格为HcmX IOcmX Imm ；3)电泳缓冲液为(192毫摩尔甘氨酸，25毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0. 1% 十二烷基硫酸钠)，在20毫安电流下电泳6小时；4)凝胶通过考马斯亮蓝G250溶液来染色，用离子交换水冲洗直至背景清晰；A3、判读SDS-PAGE图谱通过分析SDS-PAGE图谱，鉴定新疆小麦地方品种高分子量麦谷蛋白亚基组成。通过此方法，在新疆小麦地方品种中鉴定了一个新的亚基，新的亚基命名为亚基 Glu-Dl (2. 6+12) bp (t)。为育种材料评价和杂交后代高分子量麦谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择，提供了一种简单、准确、快速的实用方法。样品用量少，提取方法简单，无有毒试剂，分离迅速，分辨率高、检测灵敏度高等特点，但是，由于电泳图谱上亚基的迁移率与分子量并不总是一致，从而混淆分子量不同而迁移率相似的亚基，因此在精确度上有待进一步提尚。附图说明图1为新疆小麦地方品种(含有2. 6+12亚基)与日本小麦品种(含有2. 2+12亚基)SDS-PAGE 图谱；1. tz Iv b 二 W 2.金包银 3.农林61 4.红壳冬麦 5.么< 々办 6.红冬麦 7. ^ Lh Zts^ 8.白冬麦 9.中国春。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。一、鉴定方法1、麦谷蛋白的提取1)小麦种子单粒磨成细粉，称重20mg放入1.5ml的试管中，加入LOmlSA溶液(IOOmlSA溶液配置方法，用40ml蒸馏水溶解9. 6912g三羟甲基氨基甲烷，再加入 50ml99. 9%丙酮溶液定容至100ml，而后用盐酸将pH值调配到8.0。)在65°C条件下培养 lh。2)离心机中于2000rpm条件下离心lmin，去上清液，重复此操作过程1次。3)加入200 μ 1的SAl溶液(IOOmlSAl溶液配置方法，在IOOmlSA溶液中加入Ig二硫苏糖醇)，并在涡流震荡器上混勻。4)在65°C条件下培养lh，在13000rpm条件下离心lOmin。5)取100 μ 1的上清液，加入同样体积的SA2溶液(100mlSA2溶液配置方法，在 IOOmlSA溶液中加入1.4g乙烯基吡啶，用磁力搅拌器搅拌溶解)，在65°C条件下继续培养 30min后，加入0. 8ml的丙酮，在13000rpm条件下离心IOmin06)去上清液，沉积物在60°C条件下干燥5min，加入100 μ 1的SC溶液(IOOmlSC溶液是由20%甘油，6Μ尿素和25mmol/L醋酸混合配置而成，即称取36. 036g尿素溶于60ml蒸馏水中，在加入20ml甘油，然后量取2. 5ml IM醋酸溶液加水定容至100ml)。7)加入样品缓冲液十二烷基硫酸钠，62.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸 (pH6. 8)，10%甘油，5% 2-巯基乙醇和溴酚蓝)，混合物煮沸3min，作为SDS-PAGE分析样品保存。2、SDS-PAGE 电泳1)麦谷蛋白通过SDS-PAGE(10%分离胶(10. 3%丙烯酰胺，1. 02%甲叉双丙烯酰胺，0.375摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6. 8)，0.2%十二烷基硫酸钠，0.033%过硫酸铵和0. 05%四甲基乙二胺的混合液)和5%的积层胶(5. 0%丙烯酰胺，0. 5%甲叉双丙烯酰胺，0. 125摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6. 8)，0.02%十二烷基硫酸钠，0.033%过硫酸铵和0. 四甲基乙二胺))分离纯化。2)聚丙烯凝胶规格为14cmX IOcmX 1謹。3)电泳缓冲液为(192mM甘氨酸，25mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0. 十二烷基硫酸钠)，在20毫安电流下电泳6小时。4)凝胶通过考马斯亮蓝G250溶液来染色，用离子交换水冲洗直至背景清晰。3、判读 SDS-PAGE 图谱通过分析SDS-PAGE图谱，鉴定新疆小麦地方品种高分子量麦谷蛋白亚基组成。二、鉴定依据应用SDS-PAGE技术，以高分子量麦谷蛋白亚基标准品种=Chinese Spring (null, 7+8，2+12)，Norin 61 (2*，7+8，2. 2+12)，Eradu(1，17+18，2+12)，Cadoux(2*,13+16,2+12), Harunoakebono (2*，7+9，5+10)和 Harunoakebono 的近等基因系的替代亚基(2+12)，(6+8)， (17+18)，(20)或G+12)为对照材料，判读SDS-PAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．新疆小麦地方品种鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：Ａ１、麦谷蛋白的提取：１）小麦种子单粒磨成细粉，称重２０ｍｇ放入１．５ｍｌ的试管中，加入１．０ｍｌＳＡ溶液（５０％丙酮和０．８摩尔三羟甲基氨基甲烷－盐酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．０）），在６５℃条件下培养１ｈ；２）离心机中于２０００ｒｐｍ条件下离心１ｍｉｎ，去上清液，重复此操作过程１次；３）加入２００μｌ的ＳＡ１溶液（在ＳＡ溶液中加入１％甘油），并在涡流震荡器上混匀；４）在６５℃条件下培养１ｈ，在１３０００ｒｐｍ条件下离心１０ｍｉｎ；５）取１００μｌ的上清液，加入同样体积的ＳＡ２溶液（ＳＡ溶液中加入１．４％乙烯基吡啶），在６５℃条件下继续培养３０ｍｉｎ后，加入０．８ｍｌ的丙酮，在１３０００ｒｐｍ条件下离心１０ｍｉｎ；６）去上清液，沉积物在６０℃条件下干燥５ｍｉｎ，加入１００μｌ的ＳＣ溶液（２０％甘油，６摩尔尿素和２５毫摩尔醋酸）；７）加入样品缓冲液（２％十二烷基硫酸钠，６２．５毫摩尔三羟甲基氨基甲烷－盐酸（ｐＨ６．８），１０％甘油，５％２－巯基乙醇和溴酚蓝），混合物煮沸３ｍｉｎ，作为ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析样品保存；Ａ２、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳：１）麦谷蛋白通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％分离胶（１０．３％丙烯酰胺，１．０２％甲叉双丙烯酰胺，０．３７５摩尔三羟甲基氨基甲烷－盐酸（ｐＨ ６．８），０．２％十二烷基硫酸钠，０．０３３％过硫酸铵和０．０５％四甲基乙二胺的混合液）和５％的积层胶（５．０％丙烯酰胺，０．５％甲叉双丙烯酰胺，０．１２５摩尔三羟甲基氨基甲烷－盐酸（ｐＨ ６．８），０．０２％十二烷基硫酸钠，０．０３３％过硫酸铵和０．１％四甲基乙二胺））分离纯化；２）聚丙烯凝胶规格为１４ｃｍ×１０ｃｍ×１ｍｍ；３）电泳缓冲液为（１９２毫摩尔甘氨酸，２５毫摩尔三羟甲基氨基甲烷－盐酸和０．１％十二烷基硫酸钠），在２０毫安电流下电泳６小时；４）凝胶通过考马斯亮蓝Ｇ２５０溶液来染色，用离子交换水冲洗直至背景清晰；Ａ３、判读ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱通过分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱，鉴定新疆小麦地方品种高分子量麦谷蛋白亚基组成。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丛花，章艳凤，王宏飞，严勇亮，
申请(专利权)人：新疆农业科学院农作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：65
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