本发明专利技术公开了一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法，该方法包括的一级混合池的构建是将每一块文库保存板中每一列中的16个孔内的单克隆菌液合并成一个一级混合池；二级混合池的构建是将每一块文库保存板所对应的一级混合池合并成一个二级混合池；三级混合池的构建是按二级混合池编号顺序从1号二级混合池开始，每10个二级混合池合并成为一个三级混合池；然后用常规转基因方法将各三级混合池中的混合克隆导入受体植物，获得渗入系。该方法节省了几万次转化手续，大幅度地减轻了科研人员的工作量，达到了简便、快速，可使该渗入系达到全基因组的插入，还能简便、快速和准确地查找到供体植物的优良基因定位，有利于供体优良基因的发掘利用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属植物基因工程
，具体涉及水稻基因组大片段转化构建渗入系的方法。
技术介绍
渗入系（ Introgressing line）是通过系统回交和自交使供体染色体片段渗入到受体亲本中而获得的材料或植株，或者利用植物基因工程技术将供体植物基因组大片段导入受体亲本而获得的材料或植株。 传统的渗入系的构建方法通过多代回交和自交的方法，同时借助于分子标记图谱和分子标记辅助选择的手段分析供体染色体片段，该分子标记图谱和分子标记辅助选择的手段还局限在对该方法构建的渗入系群体的检测分析上。该方法存在不仅工作量大，而且有后代选择效率低、杂交转育后往往出现疯狂分离、不育或死亡的现象，并且育种周期长等缺陷和不足。 植物基因工程技术构建渗入系是通过构建的基因组文库，将基因组文库的克隆导入受体植物，该方法可以克服供体植物与受体植物之间的生殖障碍，但由于所构建的基因组文库通常含有数万个单克隆，如，云南药用野生稻BIBAC 文库包含53760 个克隆，在将这些单克隆导入受体亲本时也相应要做上万次导入，存在工作量庞大的缺陷和不足。因此，研究提供一种能克服以上缺陷和不足的渗入系的构建方法，是育种工作急需解决的技术问题。 野生稻（ Oryza rufipogon ）是水稻的原始祖先，世界上目前共有20多种野生稻种，其中中国有３种，即药用野生稻、普通野生稻和疣粒野生稻。中国野生稻在云南省分布最广，生太类型多。野生稻具有栽培稻所没有的丰富的、优良的特异性状，如高蛋白、分蘖力强、高抗褐飞虱和白叶枯病等优良性状,云南野生稻由于独立起源和进化，又具有其它药用野生稻不具有的结实率高等重要的特异优良性状，这些野生稻是水稻育种的宝贵资源，也是水稻基因工程研究和水稻育种获得突破的重要物质基础，常将这些野生稻作为供体植物构建渗入系。
技术实现思路
本专利技术方法要解决的技术问题是克服现有技术利用基因组文库构建渗入系 存在工作量庞大的缺陷和不足，而提供一种快速构建水稻渗入系的方法。 为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种快速构建水稻渗入系发掘优良基 因的方法，包括如下步骤：（1） 构建BIBAC基因文库混合池：①一级混合池的构建待BIBAC基因文库的文库保存板中的单克隆菌液完全融化后，将每一块文库保存板中每一列中的16个孔内的单克隆菌液合并成一个一级混合池，将一级混合池标记为（X）-y， X为文库保存板的编号, X=1，2，3，……自然数，y为每一块文库保存板中列的编号，y=1，2，3，……自然数，该一级混合池命名为（X）-y 号一级混合池； ②二级混合池的构建将每一块文库保存板所对应的一级混合池合并成一个二级混合池，将二级混合池标记为X, X=1，2，3，……自然数，该二级混合池命名为X号二级混合池；X与文库保存板的编号相同； ③三级混合池的构建按二级混合池编号顺序从1号二级混合池开始，每10个二级混合池合并成为一个三级混合池，将三级混合池记为n，n =1，2，3，……自然数，该三级混合池命名为n 号三级混合池；（2） 用常规转基因方法分别将各三级混合池中的混合克隆导入受体植物，获得渗入系。步骤(2)所述的常规转基因方法为为农杆菌介导转基因方法、基因枪、花粉管通道方法中的任一种。 所述的BIBAC基因文库为野生稻BIBAC基因文库。 所述的野生稻为药用野生稻。 所述的受体植物为栽培稻。 与现有技术相比，本专利技术方法的有益效果是： 1、本专利技术方法将BIBAC基因文库构建成基因文库混合池，将常规的药用野生稻基因文库包含的5万以上的单克隆构建成了只有10多个的三级混合池，只需将10多个三级混合池转化受体亲本，即10多次转化手续，即可构建全基因组导入的渗入系，而将常规的药用野生稻基因文库全基因导组入受体亲本，需5万次以上的转化实验才能构建渗入系，因此，本专利技术方法克服了现有技术超大的工作量的缺陷，节省了几万次转化手续，大幅度地减轻了科研人员的工作量，达到了简便、快速的目的。2、本专利技术方法因每个三级混合池含有了较多的大片段，又可简便、快速地将各三级混合池导入渗入系，可使该渗入系达到全基因组的插入。 3、本专利技术方法通过三级混合池，依次可追溯到二级混合池、一级混合池，文库保存板的某一列中的某一个孔的单克隆，因此能简便、快速和准确地查找到供体植物的优良基因定位，有利于供体优良基因的发掘利用。 附图说明图1为双元细菌人工染色体BIBAC2质粒载体物理图。 图2为一级混合池和二级混合池的构建示意图，图中(X) -1～（X）-24，表示第X块文库保存板中的24个一级混合池， X表示24个一级混合池合并成的一个二级混合池。 图3为三级混合池的构建示意图，图中1～10表示1号二级混合池至10号二级混合池共10个二级混合池合并构建1个三级混合池，1表示1号三级混合池。 图4 为携带三级混合池BIBAC2质粒的农杆菌LBA4404转化克隆中nptII基因的PCR检测，M，DL2000 marker；1为阳性对照（BIBAC2 载体为摸板）；2，为阴性对照；3-24 为7号三级混合池质粒BIBAC2电击转到农杆菌的克隆。 图5为农杆菌克隆中BIBAC2质粒携带药用野生稻基因片段的PCR检测情况，M，DL2000 marker；1-2：阴性对照（空BIBAC2载体）；3-23：携带药用野生稻片段的农杆菌克隆。 图6为渗入系中hpt基因片段的PCR检测，M：DL2000 marker；1-2：阳性对照（BIBAC2载体为模板）；3，4：阴性对照（日本晴，中花11）；5-14：日本晴渗入系；15-23：中花11渗入系。 图7为渗入系中nptII基因片段的PCR检测，M：DL2000 marker；1-2：阳性对照（BIBAC2载体为模板）3，4：阴性对照（日本晴，中花11）；5-11：日本晴渗入系；12-16：中花11渗入系。 图8是实施例2步骤（2）中4）转化子的分子检测的两个PCR反应的PCR扩增程序图。图9是实施例3步骤2中2、渗入系的hpt基因和 nptII基因检测的PCR扩增程序图。 [0022] 具体实施方式：实验材料：1、云南药用野生稻为供体材料，由云南省农业科学院生物技术及种质资源研究所提供。供体材料也可用其它水稻材料。云南药用野生稻(O.officinalis Wall.ex Watt．)是产于云南省,因独立起源和进化，具有其它药用野生稻不具有的结实率高等重要的特意优良性状，因此，特别值得开发和利用，受到本领域的重视。2、受体植物：两种栽培稻品种：日本晴、中花11，可从商业渠道购买到。其中，日本晴的全基因组序列的测定工作已经完成，这样该药用野生稻基因转入到这两个栽培稻中时，有利于药用野生稻的基因克隆与定位；中花11是农杆菌转基因常用的受体材料，外源基因比较容易转入其基因组。 3、实施例中所有试剂均能从商业渠道购买到。本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法，包括如下步骤：构建ＢＩＢＡＣ基因文库混合池：①一级混合池的构建待ＢＩＢＡＣ基因文库的文库保存板中的单克隆菌液完全融化后，将每一块文库保存板中每一列中的１６个孔内的单克隆菌液合并成一个一级混合池，将一级混合池标记为（Ｘ）－ｙ， Ｘ为文库保存板的编号， Ｘ＝１，２，３，……自然数，ｙ为每一块文库保存板中列的编号，ｙ＝１，２，３，……自然数，该一级混合池命名为（Ｘ）－ｙ 号一级混合池；②二级混合池的构建将每一块文库保存板所对应的一级混合池合并成一个二级混合池，将二级混合池标记为Ｘ， Ｘ＝１，２，３，……自然数，该二级混合池命名为Ｘ号二级混合池；Ｘ与文库保存板的编号相同；③三级混合池的构建按二级混合池编号顺序从１号二级混合池开始，每１０个二级混合池合并成为一个三级混合池，将三级混合池记为ｎ，ｎ ＝１，２，３，……自然数，该三级混合池命名为ｎ 号三级混合池；用常规转基因方法分别将各三级混合池中的混合克隆导入受体植物，获得渗入系。
【技术特征摘要】
1.一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法，包括如下步骤：
构建BIBAC基因文库混合池：
①一级混合池的构建待BIBAC基因文库的文库保存板中的单克隆菌液完全融化后，将每一块文库保存板中每一列中的16个孔内的单克隆菌液合并成一个一级混合池，将一级混合池标记为（X）-y， X为文库保存板的编号, X=1，2，3，……自然数，y为每一块文库保存板中列的编号，y=1，2，3，……自然数，该一级混合池命名为（X）-y 号一级混合池；
②二级混合池的构建将每一块文库保存板所对应的一级混合池合并成一个二级混合池，将二级混合池标记为X, X=1，2，3，……自然数，该二级混合池命名为X号二级混合池；X与文库保存板的编号相同；
③三级混合池的构建按二级混合池编号顺序从1号二级混合池开始，每10个二级混合池合并成为一个三...
【专利技术属性】
技术研发人员：程在全，黄兴奇，刘艳平，李定琴，李维蛟，余腾琼，张敦宇，殷富有，钟巧芳，付坚，王玲仙，罗红梅，李娥贤，曾黎琼，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，
类型：发明
国别省市：53
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。