本发明专利技术公开了一种制备羊包虫可溶性抗原的方法及其产品，其制备方法包括：将SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：5所示的基因在昆虫生物反应器或毕赤酵母生物反应器中进行表达；收集、纯化所表达的抗原，即得。本发明专利技术方法采用家蚕生物反应器或毕赤酵母生物反应器制备羊包虫抗原，其产物是可溶性的，免疫学实验证明其抗原性良好，单位表达量分别比大肠杆菌的量要高10-100倍，动物实验证明其具有很好的减虫效率。本发明专利技术方法可以大幅度降低羊包虫抗原的生产成本，简化了以前用大肠杆菌生产抗原的纯化过程，具有安全、高效、成本低等诸多优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗原的制备方法，尤其涉及羊包虫可溶性抗原的制备方法以及由该制备方法所制备得到的产品，属于羊包虫基因工程疫苗领域。
技术介绍
绵羊的棘球蚴病俗称包虫病(Hydatidosis，)，又被称为棘球蚴病或囊型包虫病 (cystic echinococcosis ；CE)。是由棘球属的细粒棘球绦虫(俗称羊包虫)(Echinococcus granulosus)或多房棘球绦虫(E. multilocularis)的幼虫感染绵羊所引起一种人兽共患病。它是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus ；Eg)的续绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害健康的人畜共患寄生虫病，是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。患者以儿童和青壮年居多，在人体内生长缓慢，往往在感染后5 10年才出现症状，其主要危害为压迫所寄生的器官、破坏周围组织和毒性作用。一旦棘球蚴囊膜破裂， 可引起继发性感染或休克，甚至死亡。CE呈世界性分布，主要是流行于高原和气候寒冷的牧区和半牧区，在国外主要流行于欧洲的俄罗斯、南斯拉夫、法国、德国和英国，南美洲的阿根廷、巴西、智利，大洋洲的澳大利亚和新西兰，亚洲的中国、蒙古、日本、印度、土耳其、土库曼斯坦、伊拉克等国家，另外在非洲的埃及和摩洛哥等国家也有流行；在我国，细粒棘球绦虫的危害非常严重，现已证实全国有31个省市区存在包虫病感染病例，主要流行于西北的新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏以及陕西、山西、河北和四川西部等省区，高发区约占到全国面积的44% (余森海，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2008年，26 (4) =241-44)。家犬是棘球绦虫病主要的传染源和终宿主，平均感染率为35%。感染的家犬在排出成熟节片及大量虫卵时，污染草地、水源、家居环境，或附着在其毛皮上，食草动物和人均因食入虫卵而被感染。作为中间宿主，人和10余种家畜可被感染，其中人的平均感染率为 23.0%、绵羊的平均感染率约为64%、牛55%、猪13% (卫生部，2006-2015年全国重点寄生虫病防治法规，疾控发(2006) 107号，2006，幻。据有关报道，我国有100多万包虫病现症患者，受威胁人口约5000万，包虫病畜超过4000万头，每年发病牲畜达800多万头，年经济损失超过10亿元，该病已成为西部牧区群众因病致贫、因病返贫的主要原因。随着现代社会的发展，人口流动的增加，宠物犬和经济动物狐狸的养殖数量日益增多，导致包虫病蔓延扩散(李文桂，中国人兽共患病学报，2006,22(11) =1070-72) 0另外据近年普查，全国有25个省市区有该病的散发病例报道，2005年《全国人体重要寄生虫病现状调查》的结果可知，流行区人群的血清学阳性率为1.06% 32%，人群患病率在 0. 6 % 4. 5 %之间，绵羊的棘球蚴感染率在3. 3 % 90 %之间，家犬的成虫感染率在7 % 71%之间，该病有从牧业区向农业区和城市扩散的趋势，极大地危害着人群的身体健康和畜牧业的发展，CE已成为我国乃至世界的一种危害严重的寄生虫病。细粒棘球绦虫Eg属于扁形动物门、绦虫纲、多节亚纲、圆叶目、带科、棘球属，它与多房棘球绦虫、少节棘球绦虫和福氏棘球绦虫等是目前已经被学者确认的四种棘球绦虫。4它的幼虫称棘球蚴(hydatid cyst)，为圆型或不规则的囊状体，由囊壁、生发囊、原头蚴、囊砂和囊液组成，有的还有子囊和孙囊，囊壁外由宿主的纤维组织包绕。Lightowlers等发现 Eg95是一种分子量为24. 5kDa的天然六钩蚴抗原。其编码基因全长7Mbp，其中462bp基因可编码分子量为16. 5kDa的含153个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列分析发现Eg95蛋白含纤连蛋白III型结构域，与免疫球蛋白超家族、细胞粘附分子、细胞表面受体和糖结合蛋白有部分同源性，在Eg六钩蚴入侵小肠绒毛上皮的过程中起重要作用。Woollard等用肽指纹图分析发现Eg95抗原分子呈线形，含有4个免疫显性区域，分别为2条20和40个氨基酸的序列肽(Peterson SN 等，Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92(25) :11829-11833) 包虫病的防治已经作为衡量一个国家经济发展水平和文明程度的重要指标，目前我国的寄生虫感染情况不容乐观，只相当于日本和韩国20世纪60年代到80年代的感染水平，与我国目前的社会经济的发展速度大不相适应。常用的防治手段有1、健康教育和药物与外科手术治疗健康教育是预防CE的根本措施，已发CE病例的首选治疗方法仍是外科手术，但对人体损伤较大；对于早期小棘球蚴或难做手术的病例可采用阿苯哒唑或甲苯咪唑等药物进行化疗，临床发现这些药物存在严重的毒副作用，部分患者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性，而且在发展中国家效果较差，因此这就需要研究更有效的防治措施。2细粒棘球绦虫Eg疫苗的疫苗防治近年来，分子生物学、蛋白组学、细胞学、免疫学等的研究突飞猛进，尤其是分子生物学的快速发展促进了寄生虫免疫应答和免疫诊断的研究，为研制理想的eg疫苗提供了新方法。细粒棘球绦虫Eg疫苗相应的抗原主要有特异性诊断抗原和保护性抗原，其中与诊断有关的抗原主要有天然抗原和重组抗原及合成肽，与保护性相关的抗原主要有寄生虫免疫原和分子疫苗。用于疫苗防治的抗原主要有寄生虫免疫原、基因工程抗原和多肽抗原等。寄生虫免疫原主要包括原头蚴、囊液和囊肿膜，六钩蚴或虫卵、成虫或成虫分泌物等。张文宝1999年用细粒棘球绦虫原头蚴勻浆可溶性抗原一次接种犬，孕节抑制率为 74. 1%，三次接种犬，其孕节抑制率达100%，也取得了相同的结果，这一点在流行病学上具有重要的意义，因为抑制了虫卵的产生也就切断了病原的生活史(张文宝等，中国兽医科技，1999，四(9) :23 M)。经包虫囊液免疫的羊用细粒棘球绦虫卵攻击感染时，羊的包虫囊数明显减少，但感染率则与对照组相似(贾世玉等，中国兽医杂志，1994,20(11) 40-4 。曾用囊液注射和囊肿膜诱发免疫都显示了一定的免疫效果，又用六钩蚴接种绵羊后，用细粒棘球绦虫幼虫卵攻击，结果表明免疫的绵羊都具有了坚强的抵抗力(Heath DD. In" Immunology of Echinococus，，,Edited by Thompson, The Biology of Echinococcus and Hydatid Disease. George Allen & Unwi London, 1986. 164-188)。虽然六钩蚴及排泄分泌抗原是免疫防治理想的抗原，但是其工艺化生产相当困难，来源极其有限，很难在免疫防治中大规模使用。Heath用棘球绦虫虫体的冻干粉注射幼犬，与对照组比较后其体内平均虫数大为减少，说明成虫和成虫分泌物抗原均能使犬获得不同程度的保护。基因工程抗原主要是指基因工程重组抗原疫苗、核酸疫苗以及多肽疫苗。Fraize M表达了 Eg幼虫期的两种抗原EgA31和EgTrp，试验证明了这两种抗原单独使用或混合使用都使小鼠获得了免疫应答(Heath，DD. Hie use of a Recombinant Antigen to immunize Sheep ag本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种制备羊包虫可溶性抗原的方法，包括：将ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５所示的基因在昆虫生物反应器或毕赤酵母生物反应器中进行表达；收集、纯化所表达的抗原，即得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张志芳，李轶女，易咏竹，贾如，韩宾，邹媛媛，沈桂芳，舒惠国，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11
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