本发明专利技术涉及一种对富集的稀有细胞进行检测的方法，包括进行基于免疫组化的染色与免疫荧光相结合，或基于免疫组化的双色、三色、或多色染色，以及利用荧光或普通光学显微镜或基于显微镜原理的扫描仪进行观察鉴定。本发明专利技术新颖独特的富集与染色方法已被证明成本低，且能快速高效及高特异性地富集并定量检测血中的稀有细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术主要涉及。
技术介绍
自从美国国家食品药品管理局于2004年审批通过美国Immimicon/ Veridex (Philadelphia, USA)公司的直接捕获人外周血中循环肿瘤细胞的技术后，有关获取及检测循环肿瘤细胞，循环内皮细胞，肿瘤干细胞，以及某些免疫细胞的重要的科研及临床意义已不断的被广泛报道(Cristofanilli et al，2004 New Eng J. Med. 351 :781 ；Braun and Marth，2004 New Eng. J. Med. 351 :824).然而这种利用抗体偶联磁珠直接捕获循环肿瘤细胞的方法有着尽人皆知的缺点 (Mocellin et al，2006 Trends in Molecular Medicinel2 :130)鉴于肿瘤细胞表面标志表达的异质性，所以许多肿瘤细胞不能被此种方法所捕获，这已被许多临床病例所证明；除此之外，由于肿瘤细胞被抗体偶联的磁珠“触及”并被刺激，致使这些捕获的被大量免疫颗粒包被的肿瘤细胞已不再是处于自然状态的细胞，从而很难对其进行后续分析与研究。有鉴于此，人们开始寻求其它的替代手段以获取循环稀有细胞。与直接捕获细胞技术相比， 现已公认通过去除红细胞及白细胞从而达到富集循环稀有细胞的方法是最为有效可行的替代手段。虽然某些去除或分离特定细胞群的单一实验方法已经有所报道，诸如密度离心法(U. S. Pat. No. 4，927，750)，免疫磁性颗粒法(U. S. Pat. No. 4，177，145)，红细胞裂解法，以及必须借助特殊细胞分离管的免疫磁性颗粒与密度离心的初步结合方法(U. S. Pat. No. 5，840，50 ，但所有这些方法已被证明耗时长，白细胞及红细胞去除率低，靶细胞回收率低，以及因需要某些特殊器材而带来的操作不便。基于上述原因，本专利技术对现有的几种互不关联的技术进行了优化组合，从而提供了一套新颖独特的整合方法，包括去除血浆蛋白， 加红细胞裂解，加抗体包被的免疫微球，加基于独特的细胞分离介质而成的密度离心分离方法。源于此一独特的整合试验方法的不可预知的实验结果已经被证明能够非常快速高效及高特异性地地去除血浆蛋白，白细胞及红细胞，从而达到有效富集循环稀有细胞的目的， 而且可以始终维持很高的稀有细胞回收率。迄今为止，人们所采用的所有有关从富集样品中检测循环稀有细胞包括循环肿瘤细胞及剩余白细胞的方法都是基于免疫荧光染色。然而，其不可避免的高非特异染色信号， 昂贵的荧光显微镜，以及必需但不便利的工作环境(例如暗室)极大地限制了基于免疫荧光法进行循环肿瘤细胞及循环内皮细胞检测工作的开展。本专利技术提供了基于碱性磷酸酶和过氧化物酶酶标抗体的特异组合进行双色或多色染色，从而达到检测富集的循环稀有细胞的目的。经此新方法染色过的循环稀有细胞具有很好的细胞形态，并可借助普通光学显微镜或扫描仪进行观察与分析，从而能快速简便地从剩余白细胞中检测出富集的循环稀有细胞。
技术实现思路
本专利技术提供了一套新颖独特的整合方法包括去除血浆蛋白，红细胞裂解，加入免疫微球或免疫材料以去除白细胞，加入基于独特的细胞分离介质而成的密度离心以从生物体液标本中分离循环稀有细胞。由浓缩与富集构成的本方法能够快速地从生物体液标本， 如外周血中，富集循环稀有细胞，且回收率高。富集的细胞具有可用于影像学分析的很好的细胞形态。同时，病人标本中的大部分白细胞亦可被高效回收以应用于其它研究分析，例如基因谱的研究。在本项专利技术中，任何特殊器材如细胞分离管或磁铁均不需要。本专利技术中，从人或动物收集的所述生物体液标本包括但并不局限于以下来源外周循环血，脐带血，尿液，精液，骨髓，羊水，脊髓及胸腔积液，腹水，痰液，处理过并/或勻浆化的人或动物组织，培养的人或动物细胞。所述免疫微球由特异性识别白细胞标示物的抗体与微球表面进行共价或非共价偶联而形成，所述微球的表面可经过或没有经过化学处理以适于与蛋白质相偶联，所述微球的直径介于10纳米-100微米，即IOnm-IOO μ m，所述微球包含或部分包含任何一种下列成份二氧化硅(silica)，右旋糖苷(dextran)，琼脂糖(s印harose，agarose)，或交联葡聚糖(sephadex)。用于制备所述免疫微球的微球为磁性或非磁性。在本专利技术中，用于制备免疫微球的抗体特异性地识别下述但不局限于这些白细胞表面标示物:CD3,⑶31，⑶34，⑶45，⑶50，⑶69，CD84，或CD102等。制备免疫微球过程中， 或是识别这些CD分子中的任意一种的抗体，或是识别这些CD分子中任意两种或两种以上的抗体的组合与任何适宜偶联的固体表面进行共价或非共价偶联，例如直径介于10纳米到100微米(IOnm-IOOym)的磁性或非磁性微球。本专利技术中，所述免疫吸附剂是将任何经过或没有经过化学处理的适宜结合蛋白的固体表面如硅玻璃片(Silicon glass slide)与配体(Iigand)或特异的单克隆或多克隆抗体包括抗白细胞表面标示物如CD45的抗体进行共价或非共价偶联而制备而成。本专利技术中，所述独特的细胞分离介质在20 °C温度下比重范围介于 1.07256-1. 07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，这一特定范围内的密度适于将几乎所有有核细胞与红细胞及免疫微球进行分离。所述细胞分离介质包含下列任何一种或任意两种或两种以上的试剂成份聚乙烯吡咯烷包被的胶质二氧化硅(polyvinylpyrrolidinecoated colloidal silica)；多聚糖(polysucrose)力口泛景i酸纳(sodiumdiatrizoate)或其衍生物；由蔗糖和表氯醇组成的非离子聚合物(nonionic polymer consisting of sucrose and epichlorohydrin)；或任何一种含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖(sucrose)；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide))；或任意蛋白溶液，所述细胞分离介质的比重可用任何渗透压介于280-320m0sm/kg H20, pH6. 8-7. 8的缓冲液在20°C温度下调制在 1.07256-1. 07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)范围内。所述免疫微球的比重高于所述细胞分离介质的比重。基于所述细胞分离介质的离心在普通商品化的离心管内进行。本专利技术的用于从生物体液中富集稀有细胞的方法还包括，将通过基于所述细胞分离介质的离心得到的沉积细胞以上的所有上清液全部收集。本专利技术的用于从生物体液中富集稀有细胞的方法，其中，所述裂解红细胞以去除红细胞的步骤在所述加入免疫微球或免疫吸附剂进行孵育的步骤之前、之后或者同时进行。如果本专利技术的方法不包括加入红细胞裂解液进行红细胞裂解的步骤，则可以通过长时间的离心来分离去除红细胞。本专利技术方法富集的循环稀有细胞可以应用于以下方面通过免疫荧光或免疫组化加普通光学显微镜或可见光扫描仪对所述富集的循环稀有细胞的计数；PCR ；流式细胞仪检测；基因表达谱分析；蛋白表达谱分析；酶学测定；肿瘤病人体外化疗药物的筛选；有关肿瘤病人化疗方案的制定与指导化疗的进行；对肿瘤病人体内的肿瘤细胞使用化疗药物及 /或一种或多本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种对富集的稀有细胞进行检测的方法，包括基于免疫组化的染色与免疫荧光相结合，或基于免疫组化的双色、三色、或多色染色，以及利用荧光或普通光学显微镜或基于显微镜原理的扫描仪进行观察鉴定。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林平，
申请(专利权)人：北京莱尔生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。