从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法技术

本发明专利技术涉及一种从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法，该富集方法包括：ａ）通过离心去除血浆蛋白，ｂ）可选加入红细胞裂解液进行红细胞裂解以去除红细胞，ｃ）加免疫微球或免疫吸附剂进行孵育，ｄ）进行基于独特的细胞分离介质的密度离心，用于分离循环稀有细胞与去除红细胞后的剩余红细胞及结合于所述免疫微球上的白细胞。根据本发明专利技术对富集的稀有细胞进行检测的方法包括进行基于免疫组化的染色与免疫荧光相结合，或基于免疫组化的双色、三色、或多色染色，以及利用荧光或普通光学显微镜或基于显微镜原理的扫描仪进行观察鉴定。该新颖独特的富集与染色方法已被证明成本低，且能快速高效及高特异性地富集并定量检测血中的稀有细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及乂人生物体液才羊本中富集与才企测稀有细胞的整 合方法。
技术介绍
自/人美国国家食品药品管理局于2004年审批通过美国 Immunicon/Veridex (Philadelphia, USAV^司的直4妄4乾获人外周血中 循环胂瘤细胞的技术后,有关获取及检测循环肺瘤细胞，循环内皮细 胞，肿瘤干细胞，以及某些免疫细胞的重要的科研及临床意义已不 断的4皮广泛才艮道(Cristofanilli et al, 2004 7Vew丑wg / MeJ. 351:781; Braim and Marth, 2004脸w/ Med 351:824).然而这种利用抗体偶联磁珠直接捕获循环胂瘤细胞的方法有 着尽人皆^口的击夹,存、(Mocellin et al, 2006 7Ve(is1 Mo/ecw/ar Afed/c/we 12:130):鉴于肺瘤细胞表面标志表达的异质性，所以许多肿瘤细胞 不能被此种方法所捕获，这已被许多临床病例所证明；除此之外， 由于肿瘤细胞被抗体偶联的磁珠触及并被刺激，致使这些捕获 的被大量免疫颗粒包被的肿瘤细胞已不再是处于自然状态的细胞， 从而很难对其进行后续分析与研究。有鉴于此，人们开始寻求其它的替代手段以获取循环稀有细胞。与直接捕获细胞技术相比，现已 公认通过去除红细胞及白细胞从而达到富集循环稀有细胞的方法 是最为有效可行的替代手段。虽然某些去除或分离特定细胞群的单一实-睑方法已经有所才艮道，诸如密度离心法(U.S. Pat. No. 4,927,750): 免疫》兹性颗粒法(U.S. Pat. No. 4,177,145),红细月包裂解法，以及必须 借助特殊细胞分离管的免疫磁性颗粒与密度离心的初步结合方法 (U.S. Pat. No. 5,840,502)，但所有这些方法已—皮证明耗时长，白细胞 及红细胞除率低，靶细胞回收率低，以及因需要某些特殊器材而 带来的操作不便。基于上述原因，本专利技术对现有的几种互不关联的 技术进行了优化组合，从而提供了一套新颖独特的整合方法，包括 去除血浆蛋白，力。红细胞裂解，加抗体包被的免疫微球，力口基于独 特的细胞分离介质而成的密度离心分离方法。源于此一独特的整合 试验方法的不可预知的实验结果已经被证明能够非常快速高效及 高特异性地地去除血浆蛋白，白细胞及红细胞，/人而达到有效富集 循环稀有细胞的目的，而且可以始终维持很高的稀有细胞回收率。迄今为止，人们所釆用的所有有关/人富集样品中4企测循环稀有 细胞包括循环肿瘤细胞及剩余白细胞的方法都是基于免疫荧光染 色。然而，其不可避免的高非特异染色信号，昂贵的荧光显微镜， 以及必需但不便利的工作环境(例如暗室)极大地限制了基于免疫 荧光法进行循环肿瘤细胞及循环内皮细胞检测工作的开展。本专利技术 才是供了基于石成性^粦酸酶和过氧化物酶酶标抗体的特异组合进^f亍双 色或多色染色，从而达到检测富集的循环稀有细胞的目.的。经此新 方法染色过的循环稀有细胞具有4艮好的细力包形态，并可借助普通光 学显微镜或扫描仪进行观察与分析，从而能快速简便地从剩余白细 月包中才企测出富集的循环稀有细月包。
技术实现思路
本专利技术提供了一套新颖独特的整合方法包括去除血浆蛋白，红 细胞裂解，加入免疫微球或免疫材料以去除白细胞，加入基于独特 的细胞分离介质而成的密度离心以从生物体液标本中分离循环稀 有细力包。由浓缩与富集构成的本方法能够快速i也乂人生物体液标本，如外周血中，富集循环稀有细胞，且回收率高。富集的细胞具有可 用于影像学分析的很好的细胞形态。同时，病人标本中的大部分白 细胞亦可被高效回收以应用于其它研究分析，例如基因谱的研究。 在本项专利技术中，任何特殊器材如细胞分离管或磁铁均不需要。本专利技术中，从人或动物收集的所述生物体液标本包括但并不局限于以下来源外周循环血，脐带血，尿液，精液，骨髓，羊水， 脊髓及胸腔积液，腹水，痰液，处理过并/或匀浆化的人或动物组织， i咅养的人或动物细月包。所述免疫孩i球由特异性识别白细胞标示物的抗体与微5求表面 进行共价或^一共价偶联而形成，所述微球的表面可经过或没有经过 化学处理以适于与蛋白质相偶联，所述樣i球的直径介于10纳米-100 孩史米，即lOnm-100 pm，所述孩史3求包含或部分包含寸壬何一种下列成 份二氧化硅(silica), 右旋糖普 (dextran)， 琼月旨糖(sepharose， agarose),或交联葡聚糖(sephadex)。用于制备所述免疫微球的微球 为》兹'1生或非》兹寸生。在本专利技术中，用于制备免疫樣求的抗体特异性地识别下述4旦不 局限于这些白细胞表面标示物CD3, CD31, CD34, CD45, CD50， CD69， CD84，或CD102等。制备免疫微^求过程中，或是识别这些 CD分子中的任意一种的抗体，或是识别这些CD分子中任意两种 或两种以上的抗体的组合与任何适宜偶联的固体表面进行共^介或 非共《介偶耳关，例如直径介于IO纟内米到100樣吏米(10nm-100 jim)的》兹 性或非磁性微球。本专利技术中，所述免疫吸附剂是将任何经过或没有经过化学处理 的适宜结合蛋白的固体表面如石圭^皮璃片(silicon glass slide)与配体 (ligand)或特异的单克隆或多克隆抗体包括抗白细胞表面标示物如 CD45的抗体进行共价或非共价偶联而制备而成。本专利技术中，所述独特的细月包分离介质在20°C温度下比重范围 介于1.07256-1.07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，这一特定范围内述细胞分离介质包含下列任何一种或任意两种或两种以上的试剂 成 <分聚乙烯p比p各火克包净皮的月交质二氧4匕石圭(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica); 多聚外唐 (polysucrose)力口；乏影酉交4内(sodium diatrizoate)或其衍生物；由蔗4唐和表氯醇《且成的非离子聚->物 (nonionic polymer consisting of sucrose and epichlorohydrin); 或任何 一种含^f唐的溶液，如右旋糖苷或蔗^f唐(sucrose);石典化小分子4匕合物(如甲泛影酰胺(metrizamide));或4壬意蛋白溶液，所述细月包分 离介质的比重可用4壬4可渗透压介于280-320mOsm/kg H20， pH 6.8-7.8的緩沖液在20。C温度下调制在1.07256-1.07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)范围内。所述免疫微球的比重高于所述细胞分离 介质的比重。基于所述细胞分离介质的离心在普通商品化的离心管 内进行。本专利技术的用于从生物体液中富集稀有纟田月包的方法还包括，将通 过基于所述细胞分离介质的离心得到的沉积细胞以上的所有上清 液全部收集。本专利技术的用于从生物体液中富集稀有细胞的方法，其中，所述 裂解红细月包以去除红细胞的步4聚在所述加入免疫孩U求或免疫吸附 剂进4亍孵育的步骤之前、之后或者同时进行。如果本专利技术的方法不 包括加入红细胞裂解液进行红细胞裂解的步骤，则可以通过长时间 的离心来分离去除红细月包。本专利技术方法富集的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从生物体液样本中富集稀有细胞的整合方法，包括：　ａ）通过离心去除血浆蛋白，　ｂ）可选加入红细胞裂解液进行红细胞裂解以去除红细胞，　ｃ）加免疫微球或免疫吸附剂进行孵育，　ｄ）进行基于独特的细胞分离介质的密度离心，用 于分离所述稀有细胞与去除红细胞后的剩余红细胞及结合于所述免疫微球上的白细胞。

【技术特征摘要】
1.一种从生物体液样本中富集稀有细胞的整合方法，包括a)通过离心去除血浆蛋白，b)可选加入红细胞裂解液进行红细胞裂解以去除红细胞，c)加免疫微球或免疫吸附剂进行孵育，d)进行基于独特的细胞分离介质的密度离心，用于分离所述稀有细胞与去除红细胞后的剩余红细胞及结合于所述免疫微球上的白细胞。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，从人或动物收集的所述生 物体液标本包括但并不局限于以下来源外周循环血，脐带血， 尿液，精液，骨髓，羊水，脊髓及胸腔积液，腹水，痰液，处 理过并/或匀浆化的人或动物组织，培养的人或动物细月包。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫微球由特异性识 别白细胞标示物的抗体与微球表面进行共价或非共价偶联而 形成，所述孩求的表面经过或没有经过4匕学处理以适于与蛋白 质相偶联，所述樣支球的直径介于10纳米-100纟效米，所述樣史 球包含或部分包含任何一种下列成〗分二氧化硅，右旋糖普， 琼脂糖，或交联葡聚糖。4. 根据权利要求3所述的方法，其中，用于制备所述免疫微球的 微球为磁性或非磁性的。5. 4艮据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫吸附剂是将任何 经过或没有经过化学处理的适宜结合蛋白的固体表面，如石圭玻璃片，与配体或特异的单克隆或多克隆抗体包^T抗白细月包表面标示物，如CD45的抗体，进^f于共1介或非共〗介偶联而制备而成。6. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述独特的细胞分离介质 在20。C温度下比重范围介于1.07256-1.07638克/毫升，所述 细胞分离介质包含下列任何一种或任意两种或两种以上的试 剂成份聚乙烯吡咯烷包被的胶质二氧化硅；多聚糖加泛影酸 钠或其衍生物；由蔗糖和表氯醇组成的非离子聚合物；或任何 一种含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；》典化小分子化合物(如 甲泛影酰胺)；或任意蛋白溶液，所述细胞分离介质的比重可 用任何渗透压介于280-320 mOsm/kg H20， pH 6.8-7.8的緩沖 液在20。C温度下调制在1.07256-1.07638克/毫升范围内。7. 根据权利要求1所述的方法，其中，还包括，将通过基于所述 细胞分离介质的离心得到的沉积细胞以上的所有上清液全部收集。8. 4艮据4又利要求1所述的方法，其中，所述稀有细月包是指其在采 集的生物体液冲羊本内的所有有核细月包中的占有比例小于 0.1%,它们包括循环肿瘤细胞，循环内皮细胞，胂瘤干细胞， 干细月包，及某些免疫细胞，其中所述循环肺瘤细月包来自于具有 或不具有上皮来源的任何实体瘤，如黑色素瘤等。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法富集的稀有细胞在以 下方面的应用在通过免疫荧光或免疫组化加荧光或普通光学 显微镜或可见光扫描仪对所述富集的稀有细胞的计数；PCR; 流式细胞仪才企测；基因表达i普分析；蛋白表达镨分析；酶学测 定；肿瘤病人体外化疗药物的筛选；有关肿瘤病人化疗方案的 制定与指导化疗的进行；对肿瘤病人体内的肿瘤细胞使用化疗 药物及/或一种或多种治疗肺瘤抗体效果的评估；体内或体外培养所述富集的稀有细胞；在所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：林平，
申请(专利权)人：林平，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]