利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为1,3-丙二醇制造技术

本发明专利技术涉及利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为1，3-丙二醇。具体地，本发明专利技术提供一种用单一微生物将一种碳底物生物转化为1，3-丙二醇的方法，所使用的微生物含有编码一种活性甘油脱水酶或二醇脱水酶的基因，本方法通过将这类微生物与一种碳底物在合适的发酵条件下接触来进行。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,3-丙二醇的制作方法
本专利技术包括利用单一微生物将一种可发酵的碳源生物转化为1，3_丙二醇的方法。
技术介绍
1，3-丙二醇是一种在生产聚酯纤维中和在制造聚亚胺酯及环状化合物中具有潜在应用价值的单体。已经知道有多种化学途径能够生产1，3_丙二醇。例如，可以利用一种催化剂，在存在磷化氢、水、一氧化碳、氢气和一种酸的情况下，通过丙烯醛的催化溶液相水合，然后还原，将环氧乙烷转化为1，3_丙二醇。或用碳氢化合物如甘油，在存在一氧化碳和氢气的条件下，使用含周期表第八族原子的催化剂进行反应来制备。虽然使用这些方法都能产生1， 3-丙二醇，但它们非常昂贵，并且会产生含有环境污染物的废物。人们在一个世纪前就已经知道，1，3-丙二醇可以通过发酵甘油来生产。已经在多种细菌例如柠檬酸杆菌属、梭菌属、肠杆菌属、泥杆菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属和暗杆菌属中发现了能够生产1，3_丙二醇的菌株。在每种已经研究的情况中，甘油都经两个酶促反应序列步骤转化为1，3-丙二醇，第一步，一种脱水酶催化甘油转化为3-羟基丙醛(3-HP) 和水，方程1。第二步，3-HP被一种NAD+相连的氧化还原酶还原为1，3-丙二醇，方程2。1， 3-丙二醇不再被进一步代谢，因而在培养基中高浓度积累。整个反应消耗等当量的还原性辅助因子-还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，NADH被氧化成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。甘油一3-HP+H20(方程 1)3-HP+NADH+H+ — 1,3-丙二醇 +NAD+ (方程 2)由甘油产生1，3-丙二醇一般以甘油为唯一碳源在厌氧条件下进行，并且没有其它外源的还原性等价受体。在这种条件下，在如柠檬酸杆菌属，梭菌属，和克雷伯氏菌属的菌株中，起作用的是一种甘油代谢的平行途径，这一途径包括，甘油首先被一种NAD+-(或 NADP+-)连接的甘油脱氢酶氧化为二羟基丙酮(DHA)，方程3。DHA在一种DHA激酶的作用下磷酸化后产生磷酸二羟基丙酮(DHAP)(方程4)，就可通过如糖酵解途径用于生物合成和支持ATP的产生。相对于1，3_丙二醇途径，这一途径可以为细胞提供碳源和能量，并且产生而不是消耗NADH。甘油+NAD+ — DHA+NADH+H+ (方程 3)DHA+ATP — DHAP+ADP (方程 4)在肺炎克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌中，编码功能相连的甘油脱水酶(dhaB)、l， 3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱水酶(dhaD)和二羟基丙酮激酶(dhaK)活性的基因都包含在调节子dha中。柠檬酸杆菌属和克雷伯氏菌属的dha调节子已在大肠杆菌中获得了表达，并且都显示能将甘油转化为1，3-丙二醇。制备甘油的生物过程已经知道，除一些细菌外，绝大多数甘油生产者是酵母，其它真菌和藻类也已知可产生甘油。细菌和酵母都通过糖酵解途径中的果糖-1，6- 二磷酸途径或Embden Meyerhof Parnas途径转化葡萄糖或其它碳水化合物来生产甘油，但是，某些特定的藻类将叶绿体中溶解的二氧化碳和碳酸氢盐转化成卡尔文循环中的三碳中间产物。在一系列步骤中，这种三碳中间产物-磷酸甘油被转化为3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛很容易互变为其酮异构体-磷酸二羟丙酮，并最终转化为甘油。虽然生产甘油和1，3_丙二醇的生物方法都已经知道，但一直没能证明整个过程能由单一有机体来完成。上面介绍的生产1，3_丙二醇的化学方法和生物方法都不能很好地适应于工业规模生产，因为化学过程消耗大量的能量，而生物过程需要昂贵的起始物质-甘油。因此需要一种只要求低能量输入和廉价起始物的方法。更需要这样一种方法，它应含有一种微生物， 这种微生物能将基本碳源如碳水化合物或糖转化为所需的1，3-丙二醇终产物。虽然需要能将可发酵碳源而不是甘油或二羟基丙酮转化为1，3_丙二醇的单一有机体转化，但已经证明这种努力需要克服重大的困难。例如，Gottschalk等人(EP 373 230)指出，多数对生产1，3_丙二醇有用的菌株如弗氏柠檬酸杆菌、Clostridium autobutylicum、丁酸梭菌和肺炎克雷伯氏菌，其生长会因存在氢供体如果糖或葡萄糖而受到干扰。短乳杆菌和布氏乳杆菌的菌株在甘油与果糖或葡萄糖中共发酵时能生产1，3_丙二醇，但在用甘油作唯一碳源时却不能生长，而且，虽然已经显示静止细胞能代谢葡萄糖或果糖，但它们不产生1，3_丙二醇(Veiga DA Cunha等，《细菌学杂志》174卷，1013页 (1992)) 0同样，已经显示多养泥杆菌的一个菌株，当提供甘油和乙酸时能产生1，3_丙二醇，但在没有甘油时不能由碳水化合物包括果糖和葡萄糖产生1，3_丙二醇。(Steib，《微生物学丛刊》(Arch. Microbiol. )140卷，139页(1984))。最后，Tong等人(《应用生物化学和生物技术》34卷，149页(199 )指出，转化有编码甘油脱水酶的dha调节子的重组大肠杆菌在没有外源甘油时，不能由葡萄糖或木糖产生1，3-丙二醇。提高由甘油生产1，3_丙二醇的产量的努力已经有了报导，这些方法包含能提供还原性等价物的辅助底物，典型的辅助底物为可发酵的糖类。已有人宣称弗氏柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯氏菌DSM4270的静止细胞在共发酵甘油和葡萄糖时，产量能够提高(Gottschalk 等，上文；Tran-Dinh 等，DE 3734 764)；但肺炎克雷伯氏菌 ATCC25955 的生长细胞在共发酵甘油和葡萄糖时不能产生1，3_丙二醇(I-T.Tong，Ph.D.论文， Wisconsin-Madison大学(199 )。用重组大肠杆菌在甘油与葡萄糖或果糖中共发酵时也有产量提高的报导；但在没有甘油时，不能产生1，3-丙二醇(Tong，上文)。在这些系统中， 单一有机体将碳水化合物用作产生NADH的原料，并为细胞的维持和生长提供能量和碳。这些公开内容提示，糖类并没有进入产生1，3_丙二醇的碳流动。没有一种情况是在不含外源甘油的情况下产生了 1，3_丙二醇。因此文献清楚地提示，用单一有机体由一种碳水化合物生产1，3-丙二醇是不可能的。本专利技术解决的难题是用单一有机体由廉价的碳底物如葡萄糖或其它糖类生物生产1，3-丙二醇。这种生产1，3-丙二醇的生物法需要甘油作为一个两步顺序反应的底物， 在这个两步顺序反应中，一种脱水酶(典型的酶是一种依赖辅酶B12的脱水酶)将甘油转化为中间产物3-羟基丙醛，后者随后被一种依赖于NADH-(或NADPH)的氧化还原酶还原成1， 3-丙二醇。由于所需的辅助因子非常复杂，因此用这种反应顺序生产1，3_丙二醇的工业方法必须使用完整细胞作为催化剂。而且，为使这种生产方法在经济上可行，需要比甘油或二羟基丙酮便宜一些的原料。葡萄糖和其它碳水化合物是合适的底物，但正如上面所讨论的，它们干扰1，3-丙二醇的生产。结果没有一种单一的有机体显示出能将葡萄糖转化成1， 3-丙二醇。本专利技术的申请者已经解决了上述难题，本专利技术提供使用单一有机体将一种可发酵碳源直接生物转化为1，3-丙二醇的方法。葡萄糖被用作为模式底物，而且这种生物转化方法可应用于任何存在的微生物。携带一种脱水酶基因的微生物能将葡萄糖和其它糖类通过甘油降解途径转化成1，3-丙二醇，产量和本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种生产１，３－丙二醇的生物转化方法，包括在合适的条件下，使甘油与具有至少一个能表达脱水酶的基因的单一微生物接触，所述微生物选自曲霉属、糖酵母属、接合糖酵母属、毕赤氏酵母属、克鲁维氏酵母属、假丝酵母属、汉逊氏酵母属、德巴利氏酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基细菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属的成员。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：L·A·拉芬德，V·纳加拉杰安，C·E·纳卡穆拉，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，詹伦卡国际有限公司，
类型：发明
国别省市：US