一种由葡萄糖制备(2S,3S)-2,3-丁二醇与(3S)-乙偶姻的方法技术

本发明专利技术公开了一种由葡萄糖制备(2S，3S)-2，3-丁二醇与(3S)-乙偶姻的方法，是以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella?pneumoma)CICC?10011休止细胞生物催化剂转化葡萄糖制备(2S，3S)-2，3-丁二醇与meso-2，3-丁二醇的混合物，并以枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)ATCC?23857休止细胞生物催化剂拆分(2S，3S)-2，3-丁二醇与meso-2，3-丁二醇的混合物，同时制备(2S，3S)-2，3-丁二醇与(3S)-乙偶姻。本发明专利技术方法制备的(2S，3S)-2，3-丁二醇浓度可达2.5克/升(光学纯度96.9％)，(3S)-乙偶姻浓度可达29.3克/升(e.e.96.2％)，极具工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了一种由葡萄糖制备Os，3S)-2，3-丁二醇与(3S)_乙偶姻的方法，属于生物化工

技术介绍
2，3_ 丁二醇包含 3 个异构体(2R，3R)-2，3-丁二醇，QS，3S) _2，3_ 丁二醇与 meSO-2，3-丁二醇。乙偶姻包含两个对映异构体(3R)-乙偶姻与(3S)-乙偶姻。2，3_ 丁二醇与乙偶姻的各种异构体是不对称合成中的重要原料，都是极具应用潜力的医药中间体。目前生产手性2，3- 丁二醇与乙偶姻的方法包括化学法与生物法。其中化学法反应条件复杂，难于控制，成本很高，而且产物的光学纯度很低。而生物法具有反应类型多样，反应特异性强，温度、压力条件温和，环境友好，能耗低等优势。以生物法可以生产各种2，3-丁二醇与乙偶姻的异构体，例如以meso-2，3-丁二醇为底物，以工程菌大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) (pETDuet-ydjL)为催化剂，在 pH 8. 0，37°C下反应 12 小时， 可以获得高浓度的(3S)-乙偶姻(36. 7克/升)，但是该底物价格昂贵，不适合实际生产。还有，已报道的利用生物法生产QS，3S)-2，3-丁二醇与(3S)-乙偶姻的文献如下1生产QS，3S)-2，3-丁二醇，浓度3.7克/升，对映体过量百分比(enantiomeric excess, e. e. ) 95 %，底物为乙偶姻。其方法为构建含有QS，3S) _2，3_ 丁二醇脱氢酶的工程菌大肠杆菌JM109/PMLBD119，以该工程菌为生物催化剂转化乙偶姻制备QS，3S)_2， 3- 丁二酉享(Ui, S. , Takusagawa, Y. , Ohtsuki, Τ. , Mimura, A. , Ohkuma, Μ. , Kudo, Τ., 2001.Stereochemical applications of the expression of the L_2,3—butanediol dehydrogenase gene in Escherichia coli. Lett. Appl. Microbiol. 32,93-98.)。2生产(3S)_乙偶姻，浓度3. 2克/升，光学纯度未知，底物为2，3_ 丁二醇。其方法为以含有OS，3S)-2，3-丁二醇脱氢酶的菌株解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum) C-1012 转化 2，3- 丁二醇制备(3S)-乙偶姻(Ui，S.，Masuda, H.， Muraki, H. ,1984. Laboratory-scale production of acetoin isomers(D(-)and L(+))by bacterial fermentation. J. Ferment. Technol. 62,151-156.)。然而，上述方法中使用的底物2，3_ 丁二醇与乙偶姻的成本均比较高，不适合实际生产，制约了该方法的应用。而检索结果知，以廉价的葡萄糖为底物，以两步反应同时生产 (2S，3 -2，3-丁二醇与(3S)-乙偶姻的方法，目前未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种能够以廉价的葡萄糖为原料生产Os，3S)-2，3-丁二醇与(3S)-乙偶姻的方法。本专利技术的技术构思是以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)CICC 10011 (购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的休止细胞转化葡萄糖生产03，3幻-2，3-丁二醇与!11^0-2，3-丁二醇的混合物，然后以该混合物作为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 23857(购自美国标准生物品保藏中心)的底物，利用枯草芽孢杆菌ATCC 23857将meSO-2，3-丁二醇转化为 (3S)-乙偶姻，而(2S，3S)-2，3-丁二醇仍存在于转化液中，从而实现同时生产(2S，3S)-2， 3-丁二醇与(3S)-乙偶姻。整个过程可用下式表示本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种由葡萄糖制备（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇与（３Ｓ）－乙偶姻的方法，步骤如下：（１）、制备生物催化剂：终浓度为７０～１００克细胞干重／升的肺炎克雷伯氏菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）ＣＩＣＣ　１００１１休止细胞；（２）、利用步骤（１）制备的肺炎克雷伯氏菌ＣＩＣＣ　１００１１休止细胞生物催化剂制备（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇与ｍｅｓｏ－２，３－丁二醇的混合物；其中：以菌体浓度为１４～５６克细胞干重／升的生物催化剂即肺炎克雷伯氏菌ＣＩＣＣ　１００１１休止细胞，在３７±２℃，ｐＨ　５．０～９．０条件下转化初始浓度为８０～１６０克／升的葡萄糖，反应３～１０小时后，得到含（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇与ｍｅｓｏ－２，３－丁二醇混合物的转化液；将所得转化液以８，０００±５００ｒｐｍ离心１０～１５分钟，去除所加入的生物催化剂，收集上清液进行减压蒸馏，待水份完全蒸干后，馏分即为（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇与ｍｅｓｏ－２，３－丁二醇的混合物；（３）、再制备生物催化剂：终浓度为２０～５０克细胞干重／升的枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ　２３８５７休止细胞；（４）、利用步骤（３）制备的枯草芽孢杆菌ＡＴＣＣ　２３８５７休止细胞生物催化剂拆分步骤（２）中制得的（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇与ｍｅｓｏ－２，３－丁二醇的混合物，同时制备（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇与（３Ｓ）－乙偶姻；其中：以菌体浓度为１３～２０克细胞干重／升的生物催化剂即枯草芽孢杆菌ＡＴＣＣ　２３８５７休止细胞，在２３～４５℃，ｐＨ　５．０～８．０条件下与步骤（２）中制得的（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇与ｍｅｓｏ－２，３－丁二醇的混合物进行６～２４小时的转化实验，拆分（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇与ｍｅｓｏ－２，３－丁二醇，得到含（３Ｓ）－乙偶姻的转化液；将所得转化液以８，０００±５００ｒｐｍ离心１０～１５分钟，去除所加入的生物催化剂，收集上清液进行减压蒸馏，蒸出液即为（３Ｓ）－乙偶姻的水溶液，馏分即为（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇；然后，将蒸出液与乙酸乙酯按等体积混合萃取（３Ｓ）－乙偶姻，同方法重复６～８次，合并各次萃取后的乙酸乙酯，进行减压蒸馏，得到纯品（３Ｓ）－乙偶姻；将馏分与乙酸乙酯按等体积混合萃取（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇，同法重复６～８次，合并各次萃取后的乙酸乙酯，进行减压蒸馏，得到纯品（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－丁二醇。...

【技术特征摘要】
1.一种由葡萄糖制备OS，3S)-2，3-丁二醇与(3S)-乙偶姻的方法，步骤如下(1)、制备生物催化剂终浓度为70 100克细胞干重/升的肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumonia)CICC 10011 休止细胞；O)、利用步骤(1)制备的肺炎克雷伯氏菌CICC 10011休止细胞生物催化剂制备QS， 3S) -2，3- 丁二醇与 meso-2，3- 丁二醇的混合物；其中以菌体浓度为14 56克细胞干重/升的生物催化剂即肺炎克雷伯氏菌CICC 10011休止细胞，在37士2°C，pH 5. 0 9. 0条件下转化初始浓度为80 160克/升的葡萄糖，反应3 10小时后，得到含OS，3S) -2，3- 丁二醇与meso-2，3- 丁二醇混合物的转化液；将所得转化液以8，000士500rpm离心10 15分钟，去除所加入的生物催化剂，收集上清液进行减压蒸馏，待水份完全蒸干后，馏分即为OS，3S) -2，3- 丁二醇与meso-2，3- 丁二醇的混合物；(3)、再制备生物催化剂终浓度为20 50克细胞干重/升的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) ATCC 23857 休止细胞；(4)、利用步骤(3)制备的枯草芽孢杆菌ATCC23857休止细胞生物催化剂拆分步骤⑵ 中制得的OS，3S) -2，3- 丁二醇与meso-2，3- 丁二醇的混合物，同时制备QS，3S) -2，3- 丁二醇与(3S)-乙偶姻；其中以菌体浓度为13 20克细胞干重/升的生物催化剂即枯草芽孢杆菌ATCC 23857休止细胞，在23 45°C，pH 5. 0 8. 0条件下与步骤O)中制得的QS，3S)-2，3_ 丁二醇与meso-2，3-丁二醇的混合物进行6 M小时的转化实验，拆分QS，3S) -2，3-丁二醇与meso-2，3-丁二醇，得到含(3S)-乙偶姻的转化液；将所得转化液以8，000士500rpm离心 10 15分钟，去除所加入的生物催化剂，收集上清液进行减压蒸馏，蒸出液即为(3 -乙偶姻的水溶液，馏分即为OS，3S)-2，3-丁二醇；然后，将蒸出液与乙酸乙酯按等体积混合萃取(3S)-乙偶姻，同方法重复6 8次，合并各次萃取后的乙酸乙酯，...

【专利技术属性】
技术研发人员：许平，马翠卿，刘振，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88