黑水缬草不定根培养生产缬草素的方法技术

黑水缬草不定根培养生产缬草素的方法，涉及一种生产缬草素的方法。本发明专利技术是要解决目前人工栽培的黑水缬草中缬草素含量低，植物细胞培养方法中缬草素含量不稳定的问题。方法：一、黑水缬草无菌苗的培养；二、取黑水缬草无菌苗的叶片置于固体培养基上诱导出不定根；三、诱导出的不定根接种到液体培养基中进行悬浮培养得到不定根；四、将步骤三得到的不定根经过冷冻干燥后，研磨成粉末，超声浸提，得提取液，真空过滤，干燥后得到提取物，即完成黑水缬草不定根培养生产缬草素。本发明专利技术生产的缬草素具有稳定的质量和产量，不受自然条件的限制和影响。提取物中含有质量百分比为80％～85％的缬草素。应用于缬草素生产领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生产缬草素的方法。
技术介绍
黑水缬草(V.amurensisSmir. ex Kom.)为败酱科(Valerianaceae)缬草属 (Valeriana L)野生多年生草本植物。缬草具有广泛的药理活性及悠久的用药历史，其性平味辛，具有镇静安神，解挛止痛的功效，其根茎长期以来一直作为镇静药用于民间，早在明代《本草纲目》中就有记载。据不完全统计，目前全世界有25个国家的81种缬草得到程度不同的研究。日本的北海缬草(V. officinalis var latifolia)，印度缬草(V. wallichii DC)和墨西哥缬草(V. edulis Meyer)目前仍是药用的商业来源。而目前我国对于缬草资源的开发尚处于起步阶段，仅有少量研究报道。在我国，缬草素主要从黑水缬草中获得。然而目前对于黑水缬草的获取主要还是依赖于野生缬草资源，由于多年来的过度采挖，其赖以生存的森林生态环境遭受到严重的破坏。然而人工栽培很难模拟出野生环境，其培养出的缬草的生长和代谢产物含量无法与野生植株比拟。此外人工栽培大田栽培生产周期长，占地面积大，且生产的植株和产物的品质易受到气候、栽培条件及病虫害的影响，供应难以满足市场的需求。研究非土地培植的缬草培养方法称为当务之急。目前利用生物技术进行中药资源繁殖并大规模生产其有效成分已成为一条新的发展途径，但药用植物细胞培养的弊端之一是有效成分的含量不稳定，这主要是由于大多数有效成分均为次生代谢产物，其合成在细胞阶段表现不强造成的。
技术实现思路
本专利技术是要解决目前人工栽培的黑水缬草中缬草素含量低，植物细胞培养方法中缬草素含量不稳定的问题，提供。本专利技术，按以下步骤进行一、黑水缬草无菌苗的培养将黑水缬草种子于-4°C冷冻7天，然后对种子进行除菌处理，之后置于不含激素的1/2MS培养基上萌发，得到幼苗，将幼苗移植到不含激素的MS培养基上培养，在1 光照条件下培养20 40天，得到黑水缬草无菌苗；二、取黑水缬草无菌苗的叶片置于固体培养基上，在无菌、24 ^TC条件下进行暗培养，4周后诱导出不定根，将不定根置于固体培养基中继代培养，每4周继代培养一次；三、将步骤二诱导出的不定根接种到液体培养基中进行悬浮培养，在无菌、24 ^TC、55 65r/min摇床转速下进行暗培养，4周后得到不定根，将得到的不定根置于液体培养基中继代培养，每4周继代培养一次；四、将步骤三继代培养得到的不定根经过冷冻干燥后，研磨成粉末，用二氯甲烷在25 30°C超声浸提粉末30min，离心后收集上清液，然后再重复超声浸提沉淀2次，离心后收集上清液，合并上清液，得提取液，对提取液进行真空过滤，干燥后得到提取物，即完成黑水缬草不定根培养生产缬草素；其中步骤二所述固体培养基为含有lmg/L 2，4-D、0.2mg/L KT和6g/L琼脂的MS 培养基，步骤三所述液体培养基为含有0. 2mg/L IBA和0. 2mg/L KT的MS培养基。本专利技术的优点本专利技术利用组织培养方法培养黑水缬草不定根，比培养黑水缬草细胞更具有实际意义，其生长速率比原根快很多。本专利技术方法得到的不定根与目前人工栽培的黑水缬草相比，生产的缬草素具有稳定的质量和产量，不受自然条件的限制和影响。通过人工调节与控制不定根的生长和次生产物的合成，可极大的提高缬草素的产量。缬草素占不定根组织干重的含量为4. 8 5. 06mg/g，本专利技术得到的提取物中含有质量百分比为80% 85%的缬草素。本专利技术的方法不占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室；不使用光照，不定根在暗培养条件下进行，故可节省电力，减少成本，污染率极低。附图说明图1为具体实施方式十二中种子破除休眠后萌发得到的幼苗；图2为具体实施方式十二的步骤二中诱导出的不定根在固体培养基中继代3次后的生长状态图；图3为具体实施方式十二的步骤三中不定根在液体培养基中悬浮培养4周后的生长状态；图4为缬草素标样的HPLC色谱图；图5为具体实施方式十二得到的提取物的HPLC色谱图。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式，按以下步骤进行一、黑水缬草无菌苗的培养将黑水缬草种子于_4°C冷冻7天，然后对种子进行除菌处理，之后置于不含激素的1/2MS培养基上萌发，得到幼苗，将幼苗移植到不含激素的MS 培养基上培养，在1 光照条件下培养20 40天，得到黑水缬草无菌苗；二、取黑水缬草无菌苗的叶片置于固体培养基上，在无菌、M ^TC条件下进行暗培养，4周后诱导出不定根，将不定根置于固体培养基中继代培养，每4周继代培养一次；三、将步骤二诱导出的不定根接种到液体培养基中进行悬浮培养，在无菌J4 ^TC、55 65r/min摇床转速下进行暗培养，4周后得到不定根，将得到的不定根置于液体培养基中继代培养，每4周继代培养一次；四、将步骤三继代培养得到的不定根经过冷冻干燥后，研磨成粉末，用二氯甲烷在 25 30°C超声浸提粉末30min，离心后收集上清液，然后再重复超声浸提沉淀2次，离心后收集上清液，合并上清液，得提取液，对提取液进行真空过滤，干燥后得到提取物，即完成黑水缬草不定根培养生产缬草素；其中步骤二所述固体培养基为含有lmg/L 2，4-D、0. 2mg/L KT和6g/L琼脂的MS培养基，步骤三所述液体培养基为含有0. 2mg/L IBA和0. 2mg/L KT的 MS培养基。本实施方式生产的缬草素具有稳定的质量和产量，不受自然条件的限制和影响。 通过人工调节与控制不定根的生长和次生产物的合成，可极大的提高缬草素的产量。缬草素占不定根组织干重的含量为4. 8 5. 06mg/g，本实施方式得到的提取物中含有质量百分比为80% 85%的缬草素。本实施方式的方法不占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室；不使用光照，不定根在暗培养条件下进行，故可节省电力，减少成本，污染率极低。具体实施方式二 本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述对种子进行除菌处理的方法为用无菌水将种子浸泡12h，再用无菌水涮洗5次，然后用灭菌后的滤纸吸干种子表面水分，将种子包裹于无菌纱布中，浸泡在体积浓度为75%乙醇中1分钟，无菌水清洗2次，再置于质量浓度0. 的HgCl2中5分钟，然后用无菌水清洗5次，用灭菌后的滤纸吸干表面水分。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一所述在 16h光照条件下培养20。其它与具体实施方式一或二相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一所述在 16h光照条件下培养40天。其它与具体实施方式一或二相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一所述在 16h光照条件下培养30天。其它与具体实施方式一或二相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三中摇床转速为55r/min。其它与具体实施方式一至五之一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三中摇床转速为65r/min。其它与具体实施方式一至五之一相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三中摇床转速为60r/min。其它与具本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．黑水缬草不定根培养生产缬草素的方法，其特征在于黑水缬草不定根培养生产缬草素的方法，按以下步骤进行：一、黑水缬草无菌苗的培养：将黑水缬草种子于－４℃冷冻７天，然后对种子进行除菌处理，之后置于不含激素的１／２ＭＳ培养基上萌发，得到幼苗，将幼苗移植到不含激素的ＭＳ培养基上培养，在１６ｈ光照条件下培养２０～４０天，得到黑水缬草无菌苗；二、取黑水缬草无菌苗的叶片置于固体培养基上，在无菌、２４～２６℃条件下进行暗培养，４周后诱导出不定根，将不定根置于固体培养基中继代培养，每４周继代培养一次；三、将步骤二诱导出的不定根接种到液体培养基中进行悬浮培养，在无菌、２４～２６℃、５５～６５ｒ／ｍｉｎ摇床转速下进行暗培养，４周后得到不定根，将得到的不定根置于液体培养基中继代培养，每４周继代培养一次；四、将步骤三继代培养得到的不定根经过冷冻干燥后，研磨成粉末，用二氯甲烷在２５～３０℃超声浸提粉末３０ｍｉｎ，离心后收集上清液，然后再重复超声浸提沉淀２次，离心后收集上清液，合并上清液，得提取液，对提取液进行真空过滤，干燥后得到提取物，即完成黑水缬草不定根培养生产缬草素；其中步骤二所述固体培养基为含有１ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ、０．２ｍｇ／Ｌ　ＫＴ和６ｇ／Ｌ琼脂的ＭＳ培养基，步骤三所述液体培养基为含有０．２ｍｇ／Ｌ　ＩＢＡ和０．２ｍｇ／Ｌ　ＫＴ的ＭＳ培养基。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王振宇，崔磊，周秀华，赵海田，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：93