本发明专利技术公开了一种模拟人克隆氏病的小鼠结肠炎模型及其制备方法和用途，(1)使用TNBS灌肠方法建立小鼠结肠炎模型；(2)通过大体体征观察和实时观察小鼠的活动状态来评估模型建立情况；(3)将小鼠处死后，进行临床指标的检测，取小鼠全结肠，进行长度测量及疾病评分，组织学检查，以评估小鼠模型建立情况；(4)取小鼠脾细胞进行T细胞亚群分布检查，以确立此模型的免疫细胞变化。本发明专利技术使检测临床对结肠炎用药提供了研究的载体，为研发有效的治疗药物奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物模型领域，尤其是模拟人克隆氏病的小鼠结肠炎模型及其制备方 法和用途。
技术介绍
炎症性肠病是一种常见的慢性胃肠道病，包括溃疡性结肠炎和克隆氏结肠炎，其 病因和确切的发病机理目前仍不清楚。目前普遍认为IBD的发病机制是由于遗传缺陷和环 境因素导致的遗传易感宿主对肠道菌丛的免疫应答异常，以肠道炎症为主要表现的慢性自 身性免疫疾病。近年来，随着人民群众生活水平提高，这种传统认为只在欧美有较高发病率 的疾病，在亚洲地区的发病率正在逐步升高，其中难治性IBD也显著增加。在有炎症的肠道 部位，肠的成肌纤维细胞被激活，并且上调一系列的细胞因子，化学趋化因子，生长因子以 及黏附分子，增加促加炎症的可溶性介质和细胞外基质因子的分泌。这与正常的肠道的反 应是截然不同的，正常的肠道中的肠的成肌纤维细胞是静止的，没有活性的。IBD的发病机 理可能是由于肠道菌丛和肠粘膜免疫系统的功能紊乱有关，T细胞的功能异常或者细胞因 子失衡会导致肠粘膜免疫系统异常。在正常的肠道中，效应性免疫细胞和调节性免疫细胞 通过复杂的细胞因子网络相互调节而保持稳定。而在有炎症的肠道中，对肠粘膜系统的微 生物菌丛中的无害抗原的过激的效应免疫反应或者缺乏调节性免疫反应会导致肠道粘膜 炎症，并使得肠道粘膜免疫系统的内环境稳态倾向于发生炎症。炎症性肠病与自身免疫密切相关，T淋巴细胞作为免疫调节的中心环节，CD4+T细 胞在实验性黏膜炎症扮演了极其重要的角色。CD4+T细胞作为肠黏膜炎症的主要效应细胞。 效应性CD4+T细胞迅速分裂、增殖，形成致敏淋巴细胞，又可以活化粒细胞、增强NK细胞和 LAK细胞的杀伤力，并诱导粘附分子表达及肥大细胞脱颗粒，以增进炎症反应。根据产生细 胞因子和生物功能的不同，传统上将⑶4+T细胞分为两个亚群Thl细胞和Th2细胞。⑶4+T 细胞在IL-12的作用下极化为Thl细胞，形成IFN- y ,TNF- α升高的Thl型炎症；在IL-13 的作用下极化为Th2细胞，出现IL-4、IL-5升高的Th2型炎症。克隆氏结肠炎的特征是在 胃肠道中产生透壁的肉芽肿性炎症，炎症部位通常是定位在回肠末端和升结肠，克隆氏结 肠炎是一类Thl细胞极化为主导的疾病，幼稚T细胞在IL-12，IL-18或者IL-23的诱导下 产生一系列的前炎症细胞因子，其中包括IL-2和IFN-Y。IFN-Y可以促进内皮细胞高表 达黏附分子，从而促进炎症细胞因子的募集和激活巨噬细胞。溃疡性结肠炎与克隆氏结肠 炎不同，它是由于表面的炎症而导致内皮细胞的破坏，即产生溃疡，主要的受累部位是直肠 和结肠。溃疡性结肠炎是典型的Th2细胞极化为主导的疾病，Th2细胞主要产生IL-4，IL-5 和IL-10等细胞因子。当自然杀伤T细胞激活后，大量分泌IL-13，从而介导炎症反应，通过 产生自由基和大量的前炎症因子TNF-α，IL-I，IL_6，IL_8，IL-12和IL-18，从而产生一系 列炎症及联反应。尽管这两种疾病都是针对粘膜系统的抗原的异常免疫反应，但却是通过 截然不同的生理途径导致疾病的。克隆氏结肠炎是在IL-12或者IL-23的诱导下，由Thl 细胞介导的免疫功能异常，而溃疡性结肠炎则是在激活的自然杀伤T细胞分泌的IL-13的作用下，由Th2细胞介导的免疫功能异常。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是通过TNBS诱导成稳定的结肠炎模型，并使其表现 为类似于人克隆氏病的特征，对克隆氏病进行药物筛选提供了研究基础。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是一种模拟人克隆氏病的小鼠 结肠炎模型的制备方法，包括以下步骤(1)通过直肠灌注法将TNBS注入小鼠体内；(2)通过检测小鼠的大体指征和临床 指标来判断小鼠模型是否成功建立；(3)应用流式细胞术检测小鼠脾细胞的T细胞亚群分 布，以确立模型的免疫细胞变化。所述检测小鼠的大体指征是指小鼠全结肠损伤、体重下降、精神倦怠、毛色失去 光泽、腹泻和便血。所述进行临床指标的检测是指肠组织取材及疾病评分、结肠组织病理学检查，包 括膜充血水肿，糜烂、坏死，多发溃疡，溃疡深入，部分溃疡达浆膜层，坏死严重，肠腔狭窄， 病变达小肠末端。所述取小鼠脾细胞进行T细胞亚群分布检查是指TNBS诱导的急性肠炎表现为 Thl型炎症，Thl模型的炎症特征在肉眼和光镜水平下均和CD病相似。一种模拟人克隆氏病的小鼠结肠炎模型，其特征在于，由上述的方法获得。一种模拟人克隆氏病的小鼠结肠炎模型，在筛选治疗人克隆氏疾病的药物中的应用。本专利技术的有益效果本专利技术使检测临床对结肠炎用药提供了研究的载体，为研发 有效的治疗药物奠定了基础。附图说明图1是体重变化每天称量小鼠体重，体重变化为每天的体重除以起始天的体重 的百分数，所有的数据以平均数士标准差来表示(*p < 0. 05)。图2、结肠长度。小鼠处死后，取全结肠测量长度，所有的数据以均数士标准差表7J\ ο图3、HE染色的肠切片的组化评分光镜下对肠切片进行组化评分，所有的数据以 平均数士标准差来表示。具体实施例方式本专利技术模拟人克隆氏病的小鼠结肠炎模型的制备方法，包括以下步骤(1)通过直肠灌注法将TNBS注入小鼠体内；(2)通过检测小鼠的大体指征和临床 指标来判断小鼠模型是否成功建立；(3)应用流式细胞术检测小鼠脾细胞的T细胞亚群分 布，以确立模型的免疫细胞变化。所述检测小鼠的大体指征是指小鼠全结肠损伤、体重下降、精神倦怠、毛色失去 光泽、腹泻和便血。所述进行临床指标的检测是指肠组织取材及疾病评分、结肠组织病理学检查，包括膜充血水肿，糜烂、坏死，多发溃疡，溃疡深入，部分溃疡达浆膜层，坏死严重，肠腔狭窄， 病变达小肠末端。所述取小鼠脾细胞进行T细胞亚群分布检查是指TNBS诱导的急性肠炎表现为 Thl型炎症，Thl模型的炎症特征在肉眼和光镜水平下均和CD病相似。一种模拟人克隆氏病的小鼠结肠炎模型，其特征在于，由上述的方法获得。一种模拟人克隆氏病的小鼠结肠炎模型，在筛选治疗人克隆氏疾病的药物中的应用。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明(见图1、2、3)一、TNBS小鼠模型建立应用直肠灌注法将TNBS注入小鼠体内，建立TNBS模型。1、实验动物是体重在20g左右的8周龄的BALB/c小鼠，均购自中国医学科学院 实验动物研究所，饲养在SPF洁净级的动物房。动物饲养于SPF洁净级的空调室内，室温 (22 士 2) °C，相对湿度50% -60%,自动调控昼夜各12h，颗粒饲料喂养，自由饲水。2、禁食12小时，自由饮水。3、给药方法参照国际公认的Morris方法81，实验时戊巴比妥钠麻醉，30mg/kg小 鼠°4、用一根直径为2mm的硅胶管由肛门轻缓插入深约km，灌注三硝基苯磺酸 (150mg/kg)的50%乙醇溶液(1 1)致炎；对照组的动物灌注50%乙醇溶液。5、倒提动物1分钟，使试剂可以充分进入整个结肠。6、让动物保持平躺自然清醒。二、肠炎的临床指标的检测通过大体体征观察和解剖观察来鉴定小鼠模型建立 情况。1、大体体征观察每日观察大鼠排便、进食、腹泻、活动情况。每日测量小鼠的体重变化。2、肠组织取材及疾病评分(1)每组于1，3，5天各处死5只动物。(2)处死小鼠，打开腹腔分离出全结肠本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种模拟人克隆氏病的小鼠结肠炎模型的制备方法，包括以下步骤： （１）通过直肠灌注法将ＴＮＢＳ注入小鼠体内；（２）通过检测小鼠的大体指征和临床指标来判断小鼠模型是否成功建立；（３）应用流式细胞术检测小鼠脾细胞的Ｔ细胞亚群分布，以确立模型的免疫细胞变化。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩忠朝，梁璐，董春兰，葛菁，陈小军，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：12
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