一种人血管瘤动物模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种人血管瘤动物模型，所述的动物模型由以下方法构建：a、取人血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞备用；b、将8×105～1×1010血管瘤干细胞和7×104～1×1010个人脐静脉内皮细胞用100μl的EGM-2培养液重悬，然后混匀于100μl蛋白浓度18-22mg/mL的Matrigel胶中；c、用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞混合物接种到免疫缺陷的动物皮下。本发明专利技术还提供了这种人血管瘤动物模型的构建方法和用途。本发明专利技术优点在于：所形成的血管瘤由完全具有人源化的细胞组成；血管瘤模型完全具有人类血管瘤的病理特点；非常适合于人血管瘤的发病机理研究和开发治疗人类血管瘤的药物或方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种动物模型及其构建方法和应用，具体地说，是一种血管瘤干细胞和脐静脉血内皮细胞共同构建的人血管瘤动物模型及其构建方法和应用。
技术介绍
血管瘤是婴幼儿期最常见的高发性良性肿瘤，发病率高达5_10%。，尽管能够自发性不同程度地消退，但约60%的血管瘤发生在头面部，会造成畸形，影响美观；如果发生在重要器官也可能由于肿瘤血管的破裂造成死亡的危险。目前为止，血管瘤的形成机理不明。很大程度是由于没有建立真正意义上人血管瘤动物模型造成缺乏对其基础研究的深入及对治疗该肿瘤的药物的筛选模型。目前报道的建立动物模型的方法有多瘤病毒及基因转录、血管瘤组织移植法、血管生长因子转基因技术的应用和血管瘤干细胞移植技术；但是这些血管瘤动物模型都不能模拟血管瘤生长、消退的自然过程，而且不能表现出类似的组织病理特点。由于人类血管瘤并不发生在其他物种，进一步增加了建立动物模型的难度。中国专利申请号200610087309. 4公开了一种人血管瘤鼠动物模型及其构建方法，该专利技术应用人血管瘤内皮细胞和人骨肉癌细胞系H0S、人肝癌细胞系Bel-7402或人肝癌细胞系IfepG2共同移植法建立了人血管瘤鼠动物模型。但是该方法有发展成为恶性肿瘤潜在的危险，仍然不能模拟血管瘤生长、消退的自然过程，而且不能表现出类似的组织病理特点。因此需要建立一种血管瘤的实验动物模型，克服上述已有的动物模型的缺点，建立完全类似人类的血管瘤的特性，用来研究人类的血管瘤的发生机制和筛选出特效药物等。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人血管瘤动物模型。本专利技术的再一的目的是，提供一种人血管瘤动物模型的构建方法。本专利技术的另一的目的是，提供一种人血管瘤动物模型的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是一种人血管瘤动物模型，所述的动物模型由以下方法构建a、取人血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞备用；b、将8X105 IXlOici血管瘤干细胞和7X104 1X IOltl个人脐静脉内皮细胞用 100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于100 μ 1蛋白浓度18_2aiig/mL的Matrigel胶中；C、用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞混合物接种到免疫缺陷的动物皮下。所述的人血管瘤干细胞数量为8X IO5 IX IO8个，人脐静脉内皮细胞数量为 7 X IO4 IXlO8 个。所述的人血管瘤干细胞数量为IXio6 IXlO7个，人脐静脉内皮细胞数量为 7 X IO5 IXlO6 个。所述的人血管瘤干细胞数量为IXio6个，人脐静脉内皮细胞数量为7X105个。所述的免疫缺陷的动物是指T细胞免疫缺陷的裸鼠或T细胞和B细胞严重联合免疫缺陷的SCID鼠。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是所述的动物模型的构建方法包括以下步骤a、取人血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞备用；b、将8X105 IXlOici血管瘤干细胞和7X104 1X IOltl个人脐静脉内皮细胞用 100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于100 μ 1蛋白浓度18_2aiig/mL的Matrigel胶中；C、用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞混合物接种到免疫缺陷的动物皮下。所述的人血管瘤干细胞数量为8X IO5 IX IO8个，人脐静脉内皮细胞数量为 7 X IO4 IXlO8 个。所述的免疫缺陷的动物是指T细胞免疫缺陷的裸鼠或T细胞和B细胞严重联合免疫缺陷的SCID鼠。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是所述的人血管瘤动物模型在人血管瘤形成机理的研究和制备治疗人血管瘤的药物中的应用。本专利技术优点在于1、本专利技术形成的血管瘤完全具有人源化的特点，克服以往只有部分的人源特性，应用荧光蛋白示踪技术证实，所形成的血管瘤由完全具有人源化的细胞组成；2、形成的血管瘤模型完全具有人类血管瘤的病理特点，病理组织学基础实验也证实， 血管瘤组织中存在膨大的血窦样结构和新生的毛细管等，这些病理特点与人类的血管瘤组织非常相似；3、本专利技术的动物模型非常适合于人血管瘤的发病机理研究和开发治疗人类血管瘤的药物或方法，及评价各种治疗血管瘤药物的疗效和筛选治疗血管瘤的药物。附图说明附图1是体外培养的人血管瘤干细胞及其鉴定。A.用MTT分析检测的生长曲线显示分离培养出来的干细胞具有旺盛的增殖能力，在10天内细胞数目扩增到了初始的16倍； B. RT-PCR结果显示⑶133分选出来的阳性细胞表达干细胞特异性基因0ct_4，而阴性细胞明显表达明显减弱，S9为内参；C.流式细胞分析显示分离培养的干细胞表达CD^KCD44等间充质干细胞的标记。附图2是对照组皮下注射HUVEC的Matrigel凝胶。附图3是皮下注射HemSC+HUVEC的Matrigel凝胶。 附图4是皮下注射HemSC+HUVEC成瘤组织的HE切片。附图5是肿瘤动物模型。具体实施例方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1①血管瘤干细胞(HemSC)的分离、培养a、取新鲜离体的人血管瘤组织，用加双抗的DMEM液反复冲洗组织块，去除血凝块。b、将标本放入IOcm2细胞培养皿中，加入少许DMEM培养液浸润，用眼科剪将组织块剪成Imm长条状，用DPBS再次反复冲洗去除残余的血凝块后放入15ml离心管中，加入浓度为2.如/ml的中性蛋白酶II (Dispase II)溶液10 ml，于4度冰箱过夜。c、取出15ml离心管，吸去中性蛋白酶II液，用PBS洗2遍，将组织块放入IOcm2细胞培养皿中，用眼科剪将组织剪成Imm3大小的组织碎片后，置于15ml离心管中，加入IOml 的0. 2% I型胶原酶在37度水浴箱摇床内消化3h，在胶原酶消化2小时时加入浓度为25u/ ml的DNA酶Iml共消化1小时。d、以800g离心力离心5分钟，弃上清，用DMEM液重悬，重复1次以去净脂肪。e、先以150目金属滤网过滤细胞悬液，再以一次性30 μ m无菌滤膜过滤，滤液以 600g离心5分钟，弃上清，用5mlPBS/0. 1%BSA液重悬，血球计数板计数。②血管瘤干细胞磁珠分选a、以300g离心细胞悬液10分钟，完全吸去上清；b、加300 μ 1PBS/0. 1%BSA 液重悬；C、加入100 μ 1 FcR封闭液(Miltenyi磁珠试剂盒)；d、加入100μ 1的CD133磁珠；e、混合好后在4度孵育30分钟，每5分钟摇勻一次；f、加入2ml的PBS/0.5% BSA液洗并以300g离心10分钟，弃上清；g、加入500 μ 1 的 PBS/0. 5% BSA 液重悬；h、将磁珠安放在磁铁上；i、用500μ 1的PBS/0. 5% BSA液洗柱预备；j、把细胞加入柱中，收集流下的未标记的细胞；k、用500 μ 1的PBS/0. 5% BSA液洗柱3次，收集流下的未标记细胞；1、去除磁铁并换收集管；m、吸取lml500 μ 1的PBS/0. 5% BSA液加入磁柱，洗出磁珠标记的细胞，洗3次，最后1 次通过稳推最大限度地洗出磁珠标记的细胞。重复h-m步一次以提高纯度；η、细胞悬液以300g离心10分钟，将分选出的⑶133阳性细胞加入EGM_2/20%FBS培养基在6孔板内培养。③血管瘤干细胞(HemS本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种人血管瘤动物模型，其特征在于，所述的动物模型由以下方法构建：ａ、取人血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞备用；ｂ、将８×１０５～１×１０１０血管瘤干细胞和７×１０４～１×１０１０个人脐静脉内皮细胞用１００μｌ的ＥＧＭ－２培养液重悬，然后混匀于１００μｌ蛋白浓度１８－２２ｍｇ／ｍＬ的Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶中；ｃ、用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞混合物接种到免疫缺陷的动物皮下。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑家伟，麦华明，袁伟恩，
申请(专利权)人：郑家伟，麦华明，袁伟恩，
类型：发明
国别省市：31