用肠杆菌科的细菌产生L-氨基酸的方法技术

本发明专利技术涉及用肠杆菌科的细菌产生L-氨基酸的方法，具体地公开了利用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸，例如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸的方法，其中所述细菌经修饰增强了D-木糖通透酶的活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过发酵产生L-氨基酸的方法，更具体地涉及有助于此发酵的基因。 这些基因可用于改进L-氨基酸的生产，例如，L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的生产。
技术介绍
传统上，利用由天然来源获得的微生物菌株或其突变体通过发酵方法工业化生产 L-氨基酸。通常，修饰所述微生物以提高L-氨基酸的产品收率(production yield)。已经报导了许多提高L-氨基酸产品收率的技术，包括用重组DNA转化微生物(参见，例如，美国专利4，278，76 。其它提高产品收率的技术包括增加涉及氨基酸生物合成的酶的活性和/或使目标酶对所得L-氨基酸的反馈抑制脱敏(desensitize)(参见，例如，WO 95/16042 或美国专利 4，346，170,5, 661，012 和 6，040，160)。用于通过发酵生产L-苏氨酸的菌株是已知的，包括涉及L-苏氨酸生物合成的酶的活性增加的菌株(美国专禾U 5，175，107,5,661,012,5, 705, 371和5，939，307 ；EP 0219027)、对化学品如L-苏氨酸及其类似物有抗性的菌株(W001/14525A1、EP 301572A2、 美国专利5，376，538)、具有对生产的L-氨基酸或其副产物的反馈抑制脱敏的目标酶的菌株(美国专利5，175，107和5，661，012)、以及具有失活的苏氨酸降解酶的菌株(美国专利 5，939，307 和 6，297，031)。目前，已知的生产苏氨酸的菌株VKPM B-3996(美国专利5，175，107和5，705，371) 是最好的已知的苏氨酸生产菌之一。为构建菌株VKPM B-3996，如下所述，将几个突变和质粒导入到亲本菌株大肠杆菌K-12(VKPM B-7)中。突变的thrA基因(突变thrA442)编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I，其对苏氨酸的反馈抑制有抗性。突变的ilvA基因(突变 ilvA442)编码活性降低的苏氨酸脱氨酶，其导致异亮氨酸生物合成速率降低和异亮氨酸饥饿的渗漏表型。在包含ilvA442突变的细菌中，thrABC操纵子的转录不被异亮氨酸所抑制，因此对于苏氨酸生产是非常有效的。编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因的失活阻止苏氨酸降解。将蔗糖同化的遗传定子(genetic determinant) (scrKYABR基因)转移到所述菌株。 为增加控制苏氨酸生物合成的基因的表达，将包含突变的苏氨酸操纵子thrA442BC的质粒 PVIC40导入中间菌株TDH6中。在菌株发酵期间累积的L-苏氨酸的量能够多达85g/l。通过优化所需化合物的主要生物合成途径，借助于为细菌补充更大量的糖例如葡萄糖作为碳源，可以完成对L-氨基酸生产菌株的进一步改善。不考虑PTS的葡萄糖转运效率，在高产菌株中获取碳源仍然可能是不充足的。已知糖和其它代谢物向细菌细胞中的主动运输由几种转运系统完成。其中，来自大肠杆菌的XylE蛋白是D-木糖通透酶，大肠杆菌中两种系统的其中一个负责吸收D-木糖；另一个是ATP-依赖性ABC转运蛋白Xy 1FGH。已显示克隆的xylE基因在体内补充xylE 突变体(Davis, Ε. 0. and Henderson, P. J.，J. Biol. Chem.，262 (29) ； 13928-32 (1987)) 在整个细胞中XylE-介导的转运由质子载体(protonophore)所抑制，并引发碱性pH改变(Lam, V. Μ.等，J. Bacteriol. 143(1) ；396-402 (1980))。利用 xylE 和 xylF 突变体的试验已证实对于D-木糖，XylE蛋白具有63_169μΜ的KM(Sumiya.M.等，Receptors Channels, 3 (2) ； 117-28 (1995)) 0 XylE蛋白是转运蛋白主要促进剂超家族(major facilitator superfamily) (MFS)的成员(Griffith，J. K.等，Curr. Opin. Cell Biol. 4(4)； 684-95 (1992))，看起来作为D-木糖/质子同向转运蛋白(symporter)起作用。xylE基因可能构成单顺反子操纵子，其表达由D-木糖所诱导。输入的木糖在XylA(木糖异构酶)和 XylB(木酮糖激酶)酶的作用下异化为5-磷酸木酮糖。在合适的条件下，由xylA基因编码的木糖异构酶还有效地催化D-葡萄糖向D-果糖的转化(Wovcha，Μ. G.等，Appl Environ Microbiol. 45(4) 1402-4 (1983))。然而，迄今还没有利用肠杆菌科(Enterobacteriaceae family)的细菌增加L-氨基酸的生产的报导，所述肠杆菌科的细菌具有增强的D-木糖通透酶活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是增加产生L-氨基酸的菌株的生产力，以及提供用这些菌株生产非芳族或芳族L-氨基酸的方法。通过发现增加编码D-木糖通透酶的xylE基因的表达能增强L-氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的生产而实现了该目标。由此完成了本专利技术。本专利技术的目的是提供肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，其中所述细菌经改造以增强D-木糖通透酶的活性。本专利技术的又一目的是提供上述的细菌，其中所述D-木糖通透酶的所述活性通过增加编码D-木糖通透酶的基因的表达而增强。本专利技术的又一目的是提供上述细菌，其中通过修饰编码D-木糖通透酶的基因的表达控制序列以增强基因表达，或者通过增加编码D-木糖通透酶基因的拷贝数，而增强 D-木糖通透酶的所述活性。本专利技术的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强葡糖激酶的活性。本专利技术的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强木糖异构酶的活性。本专利技术的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌经修饰而增加了 xylABFGHR位点的表达。本专利技术的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌选自下组菌属埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、普罗威登斯菌属(ftOvidencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、和摩根氏菌属(Morganella)。本专利技术的又一目的是提供上述细菌，其中所述基因编码选自下组的D-木糖通透酶(A)包含氨基酸序列SEQ ID NO 2的蛋白质；和(B)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的变体蛋白质，其具有D-木糖通透酶的活性。本专利技术的又一目的是提供上述细菌，其中所述编码D-木糖通透酶的基因包含选自下组的DNA:(a)包含SEQ ID NO=I中核苷酸1至1476的核苷酸序列的DNA ；和(b)在严紧条件下可与SEQ ID NO 1中核苷酸1_1476的核苷酸序列或由所述核苷酸序列制备的探针杂交，并且编码具有D-木糖通透酶活性的蛋白质的DNA。本专利技术的又一目的是提供上述细菌，其中所述严紧条件包括其中在60°C在Ix SSC和0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．生产Ｌ－苏氨酸的方法，其包括在培养基中培养产生Ｌ－苏氨酸的大肠杆菌以使Ｌ－苏氨酸在所述培养基中积累，并从所述培养基分离Ｌ－苏氨酸，其中所述大肠杆菌已经过修饰而增强了编码ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２的氨基酸序列的ｘｙｌＥ基因的表达，而且其中通过将所述ｘｙｌＥ基因置于包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３的核苷酸序列的强启动子的控制下而增强了所述ｘｙｌＥ基因的表达。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：康斯坦丁V赖贝克，埃卡特里那A斯利文斯卡亚，埃卡特里那A赛维拉索瓦，瓦莱里Z阿克维迪安，埃琳娜V克里亚奇科，瑟奇V马什科，薇拉G多罗申科，拉里萨G埃里克，塔特亚娜V里奥诺娃，米克海尔M古斯亚蒂纳，埃尔韦拉B沃罗什洛娃，尤里I科兹洛夫，原吉彦，植田拓嗣，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP