赖氨酸的发酵制备制造技术

本发明专利技术提供了L-赖氨酸的发酵方法，其包括将编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体；和在发酵条件下培养获得的菌。另外，本发明专利技术还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于氨基酸发酵领域，具体而言，本专利技术涉及L-赖氨酸的发酵方法，其包括将编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体；和在发酵条件下培养获得的菌。另外，本专利技术还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等。
技术介绍
L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。二氢吡啶二羧酸合成酶变体是L-赖氨酸代谢途径上重要的酶。尽管野生型吡二氢吡啶二羧酸合成酶及其部分变体已经被公开(可参见NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登录号AAC75531. 1 ；也可参见中国专利ZL94194962)，但是该酶的其他变体的研究却没有报道，也没有启示在新的位点上突变。本专利技术人经过长期艰苦研究，令人意外地发现了新的二氢吡啶二羧酸合成酶，其在导入工程菌发酵的时候也获得了更高的赖氨酸产量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供L-赖氨酸的发酵方法，其包括将编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体。另外，本专利技术还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等具体而言，在第一方面，本专利技术提供了 L-赖氨酸的发酵方法，其包括(1)将编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体，其中所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体在野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的M13、V60或A83的位置上被其他天然氨基酸替换；和(2)在发酵条件下培养步骤(1)获得的菌。其中，野生型二氢吡啶二羧酸合成酶是本领域技术人员所知晓的，其序列如 NCBI (http//www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登录号 AAC75531. 1 所示。优选本专利技术第一方面的发酵方法中，所述多核苷酸编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体，如其核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。优选本专利技术第一方面的发酵方法中，所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体在野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的M13、V60和A83的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自M13K、V60L和A83G。在本专利技术的具体实施方式中，所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示。本领域技术人员可以根据二氢吡啶二羧酸合成酶变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本专利技术的具体实施方式中，所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体由如SEQ ID No:2所示的多核苷酸编码。所述多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入产L-赖氨酸的菌，只要能够使产L-赖氨酸的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶变体即可。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。通常，由于产L-赖氨酸的菌本身不适于作为克隆宿主菌，因此优选所述多核苷酸是通过穿梭质粒导入产L-赖氨酸的菌的。其中，所述穿梭质粒优选是大肠杆菌和产L-赖氨酸的菌的穿梭质粒。这样便能够很方便地在大肠杆菌宿主中进行DNA重组操作。产L-赖氨酸的菌有许多种，本领域技术人员所知晓的包括埃希氏杆菌、棒状杆菌和沙雷氏杆菌，优选是棒状杆菌。在本专利技术的具体实施方式中，所述产L-赖氨酸的菌是 Corynebacterium glutamicum0优选本专利技术第一方面的发酵方法中，所述发酵条件的发酵温度为观_351，优选为 29-33 0C，更优选为 30-32 0C，如 30 °C。也优选本专利技术第一方面的发酵方法中，所述发酵条件的培养基包含糖，NH4Cl, CaCl2,KH2PO4，蛋白胨，MgSO4,FeSO4,MnSO4，生物素，和叶酸。在本专利技术的具体实施方式中，所述培养基的配方为:40g蔗糖，20g NH4Cl, 2g CaCl2, IgKH2PO4, Ig蛋白胨，5OOmg MgSO4 ·7Η20， 15mg FeSO4 ·7Η20，IOmgMnSO4 ·7Η20，200 μ g 生物素，和 50 μ g 叶酸，ρΗ7· 3，用水补足至 1 升。在第二方面，本专利技术提供了 L-赖氨酸饲料添加剂的制备方法，其包括(1)实施本专利技术第一方面的发酵方法中的步骤⑵；和(2)收集发酵液依次进行膜分离并对滤液进行喷雾干燥；(3)对步骤⑵喷雾干燥获得的颗粒进行筛分；(4)将筛分得到的粒径大于等于1. 5mm的颗粒破碎，并将其与筛分得到的粒径小于1. 5mm的颗粒混合，再次进行喷雾干燥；和(5)对步骤(4)喷雾干燥获得的颗粒进行筛分，收集粒径小于1. 5mm的颗粒。其中，为了使最终颗粒饲料添加剂的形状更为均勻，流化床干燥机内尾气温度不宜过高，通常不应高于85 °C，优选保持在80 士 3°C。本专利技术第二方面的制备方法还可以在实施本专利技术第一方面的发酵方法中的步骤 (2)之前，包括实施本专利技术第一方面的发酵方法中的步骤(1)。但是，这通常不是优选的，因此本专利技术第二方面的制备方法不包括实施本专利技术第一方面的发酵方法中的步骤(1)，而包括在发酵条件下培养产L-赖氨酸的菌(尤其是高产L-赖氨酸的菌)的步骤，这也涵盖在本专利技术的范围内。由于本专利技术第二方面的制备方法已经能够生产出符合国家标准的颗粒饲料添加剂，因此优选其中不包括包衣的过程，相应可以降低成本，更便于商业推广。在第三方面，本专利技术提供了根据本专利技术得到的产品以及本专利技术中使用的中间产物。具体而言，本专利技术提供了根据本专利技术第二方面的制备方法得到的L-赖氨酸饲料添加剂，优选其中不含包衣剂(如，环糊精等)。另外，本专利技术提供了二氢吡啶二羧酸合成酶变体，其在野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的M13、V60或A83的位置上被其他天然氨基酸替换。优选所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体在野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的M13、V60和A83的位置上被其他天然氨基酸替换， 优选替换选自M13K、V60L和A83G。在本专利技术的具体实施方式中，所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体的氨基酸序列如SEQ IDNo 1所示。相应地，本专利技术提供了编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体的多核苷酸，优选其核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。本专利技术具有以下有益效果赖氨酸的发酵产量得到有效提高；发酵液质量稳定； 变体酶与野生型酶结构差异不大，都可以顺利降解，无安全隐患；发酵液可以直接用于生产颗粒饲料添加剂；生产颗粒饲料添加剂的步骤简便，无需引入包衣剂即可达到国家标准的要求。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本专利技术进行详细地描述。需要特本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．Ｌ－赖氨酸的发酵方法，其包括：（１）将编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体的多核苷酸导入产Ｌ－赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体，其中所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体在野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的Ｍ１３、Ｖ６０或Ａ８３的位置上被其他天然氨基酸替换；和（２）在发酵条件下培养步骤（１）获得的菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马吉银，陈崇安，孟刚，曹洪，程耀东，刘鑫，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：64