基于ｐＨ的反馈补料生产赖氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及发酵法生产赖氨酸，具体涉及基于ｐＨ的反馈控制补加碳源和氮源发酵生产赖氨酸的方法。在赖氨酸好氧发酵进行过程中，利用ｐＨ的反馈来控制发酵液的ｐＨ在６．５～７．５之间的任意一个值附近波动；所述控制包括向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液、硫酸铵和氨的混合溶液、或葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液来控制发酵液的ｐＨ在６．５～７．５之间的任意一个值附近波动；从而分别间接维持了发酵液中葡萄糖的浓度在预先设定点附近波动、间接维持了发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比在预先设定点附近波动、间接维持了发酵液中葡萄糖的浓度在预先设定点附近波动，且发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比在预先设定点附近波动。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及发酵法生产赖氨酸的方法，具体地说涉及一种基于PH的反馈控制补 加碳源和氮源发酵生产赖氨酸的方法。
技术介绍
L-赖氨酸(以下简称赖氨酸)是八种人体必需氨基酸中最重要的一种，它对调节 生物体内代谢平衡，提高生物对谷类蛋白质的吸收，改善人类膳食营养和动物营养，促进生 长发育均有重要作用。赖氨酸被广泛用作动物饲料添加剂、食品添加剂、药品等。2006年全 球赖氨酸的消费量达到85万吨，其中90%的赖氨酸用作饲料添加剂，约5%用作食品添加 剂，5%用作医药中间体。赖氨酸的工业生产始于1958年，日本木下祝郎、中山清等采用紫外线照射谷氨酸 棒杆菌得到了一株营养缺陷型突变株，其L-赖氨酸生成量达到工业生产水平。目前，微生 物发酵法已成为生产赖氨酸的主要方法，工业生产规模逐年扩大。近年来，随着原材料价格 的上涨和市场的激烈竞争，为了提高赖氨酸产率和降低生产成本，仍有大量关于赖氨酸发 酵方面的研究报道，主要集中在选育高产赖氨酸菌株、改进发酵工艺和开发新资源等方面。赖氨酸产生菌属于具有多重遗传标记的突变株，能在胞外大量积累赖氨酸是由于 菌体的代谢调节处于异常状态，对环境条件非常敏感。发酵条件如碳源、氮源、无机盐、PH及 溶解氧等对赖氨酸的合成有重要影响。其中，底物(葡萄糖)浓度是影响菌体代谢的一个 重要参数，它主要通过控制相关酶的合成或活性影响菌体的代谢途径，通常称作葡萄糖效 应(俞俊棠，《新编生物工艺学》，化学工业出版社，2003年，110页)。葡萄糖可通过“葡萄 糖效应”阻遏、抑制多种酶的合成，如氨基酸合成酶等，这种阻遏作用主要是其分解代谢物 引起的。在以葡萄糖为碳源的赖氨酸发酵中，葡萄糖的分解代谢物阻遏会引起多种副产物 如丙氨酸等的积累，从而影响糖对赖氨酸的转化率(张克旭，《代谢控制发酵》，中国轻工业 出版社，1998年，299页)。目前，赖氨酸发酵主要采用的是批式发酵模式。在菌体生长阶段需要提供一定 浓度的葡萄糖以获得足够浓度的菌体，而在菌体产酸阶段需要维持较低的葡萄糖浓度，这 样能够激活赖氨酸合成途径的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，从而强化二氧化碳固定反 应，提高赖氨酸产率。为了实现上述发酵模式，在赖氨酸的生产过程中一般采用补料的方 法，但是现有的补料方法主要是按照预定程序流加，属于无反馈的流加，虽然操作比较简 单，但是不能真实反映发酵过程中葡萄糖浓度的变化；或者靠人工定时取样分析再调整流 加速率，糖浓度的控制滞后，导致葡萄糖浓度波动大。另外，由于在线测定葡萄糖浓度有困 难，所以目前无法实现在线测定发酵液中葡萄糖的浓度并及时反馈控制。因此在赖氨酸发 酵生产过程中，其补料具有盲目性，发酵生产的重复性也较差。在赖氨酸发酵生产过程中，准确控制及时补加氮源也是十分重要的。在赖氨酸发 酵生产的不同阶段，菌体内的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的二氧化碳固定反应与丙酮酸 激酶催化生成丙酮酸的途径的分配系数直接影响赖氨酸的得率。由于发酵液中铵根和硫酸根的存在能够激活赖氨酸合成途径中关键酶天冬氨酸激酶(文献Agric. Biol. Chem.， 1979，43 (12)，P. 2480)，有利于解除天冬氨酸对于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反馈抑制，增 加二氧化碳固定反应的代谢流量，从而达到强化赖氨酸合成途径的效果，所以发酵液中的 硫酸铵浓度与上述的分配系数直接有关，维持适宜的硫酸铵浓度是调节上述两个途径分配 系数的关键。因此在赖氨酸的发酵生产中还需要流加氮源硫酸铵和氨，既维持了适宜的PH 值，又能够提高赖氨酸的产量。在赖氨酸的发酵生产中目前普遍采用的是按照预定程序或 人工定时取样分析后流加硫酸铵，用发酵液的PH值作为反馈信号控制氨的流加。这种方式 导致硫酸铵浓度(相当于铵离子摩尔浓度的二分之一，在发酵的PH下，发酵液中氨的存在 形态主要是铵离子)的控制也不精确并且重复性差，影响赖氨酸的发酵生产。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于克服现有的赖氨酸生产方法在补料时具有盲目性，影响生 产控制，使得发酵产量低的缺陷。提供一种通过检测发酵液中的PH变化，利用pH值反馈控 制补料，维持一定的葡萄糖浓度和/或维持一定的硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比，从而简化 生产工艺，在不增加额外设备的情况下使赖氨酸的发酵产量大幅度提高的PH反馈补料生 产赖氨酸的方法。本专利技术的目的之二在于上述维持一定葡萄糖浓度和/或维持一定的硫酸铵与赖 氨酸摩尔浓度比的基础上，提出了分段控制赖氨酸发酵生产的方法，进一步促进赖氨酸的 发酵生产。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的本专利技术提供的，包括使用常规方法制备生 产赖氨酸的种液，然后进行赖氨酸好氧发酵；本专利技术是在赖氨酸好氧发酵进行过程中，按照 赖氨酸好氧发酵过程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之间的比例关系(该比例关系可以 由本领域技术人员针对不同的发酵菌种自行测定得到)，配制葡萄糖和氨的混合溶液，通过 向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的pH在6. 5 7. 5之间的任意一个值附近波动， 使之既不产生葡萄糖抑制，也不构成限制，达到维持一定的葡萄糖浓度，从而提高赖氨酸发 酵产量的目的。此时硫酸铵的流加可采用常规方法；或，在赖氨酸好氧发酵进行过程中，按照赖氨酸好氧发酵过程中所需的硫酸铵添 加速率(由赖氨酸合成速率乘以拟维持的发酵液中的硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比得到)和 氨消耗速率之间的比例关系(该比例关系可以由本领域技术人员针对不同的发酵菌种自 行测定得到)，配制硫酸铵和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液 的pH在6. 5 7. 5之间的任意一个值附近波动，使之既不产生硫酸铵抑制，也不构成限制， 达到维持一定的硫酸铵与产生的赖氨酸摩尔浓度比，从而提高赖氨酸发酵产量的目的。此 时葡萄糖的流加可采用常规方法；或，在赖氨酸好氧发酵进行过程中，按照赖氨酸好氧发酵过程中葡萄糖消耗速率、 所需的硫酸铵添加速率(由赖氨酸合成速率乘以拟维持的发酵液中的硫酸铵与赖氨酸摩 尔浓度比得到)和氨消耗速率之间的比例关系(该比例关系可以由本领域技术人员针对不 同的发酵菌种自行测定得到)，配制葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加 该混合溶液来控制发酵液的pH在6. 5 7. 5之间的任意一个值附近波动，使之既不产生葡萄糖抑制和硫酸铵抑制，也不构成限制，达到维持发酵液中一定的葡萄糖浓度和维持一定 的硫酸铵与产生的赖氨酸摩尔浓度比，从而提高赖氨酸发酵产量的目的；或，将上述3种控制发酵液的pH在6. 5 7. 5之间的任意一个值附近波动的技术 方案联合使用，来控制发酵液的pH在6. 5 7. 5之间的任意一个值附近波动。本专利技术的具体包括以下步骤(1)按常规方法制备生产赖氨酸的种液配制生产赖氨酸的种子培养基，按常规 方法灭菌；将生产赖氨酸的菌种接入生产赖氨酸的种子培养基中；在适宜的温度下摇床培 养至对数期得到生产赖氨酸的种液；(2)好氧发酵将步骤(1)制得的生产赖氨酸的种液接入经常规方法灭菌的生产 赖氨酸的发酵培养基中，得到发酵液，其中生产赖氨酸的种液的接种量为生产赖氨酸的发 酵培养基质量的8% 18%，发酵液中的初始葡萄糖浓度为40克/升 180克/升；在好 氧发酵的过程中控制发酵液的温度为30°C 34°C，利用pH的反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于ｐＨ的反馈补料生产赖氨酸的方法，其特征是：在赖氨酸好氧发酵进行过程中，利用ｐＨ的反馈来控制发酵液的ｐＨ在６．５～７．５之间的任意一个值附近波动；所述的控制发酵液的ｐＨ在６．５～７．５之间的任意一个值附近波动是：　　（１）按照赖氨酸好氧发酵过程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之间的比例关系，配制葡萄糖和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的ｐＨ在６．５～７．５之间的任意一个值附近波动；或　　（２）按照赖氨酸好氧发酵过程中所需的硫酸铵添加速率和氨消耗速率之间的比例关系，配制硫酸铵和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的ｐＨ在６．５～７．５之间的任意一个值附近波动；或　　（３）按照赖氨酸好氧发酵过程中葡萄糖消耗速率、所需的硫酸铵添加速率和氨消耗速率之间的比例关系，配制葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的ｐＨ在６．５～７．５之间的任意一个值附近波动；或　　（４）将上述（１）、（２）和（３）所述的３种控制发酵液的ｐＨ在６．５～７．５之间的任意一个值附近波动的技术方案联合使用，来控制发酵液的ｐＨ在６．５～７．５之间的任意一个值附近波动。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丛威，刘辉，张勇，邢宇，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：11