本发明专利技术提供了L-赖氨酸的发酵方法，其包括将以非天然顺序编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶；和在发酵条件下培养获得的菌。另外，本发明专利技术还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于氨基酸发酵领域，具体而言，本专利技术涉及L-赖氨酸的发酵方法，其包括将以非天然顺序编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶；和在发酵条件下培养获得的菌。另外，本专利技术还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等。
技术介绍
L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。吡啶核苷酸转氢酶是L-赖氨酸代谢途径上重要的酶。尽管野生型吡啶核苷酸转氢酶的亚基已经被公开(可参见NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih. gov)蛋白和基因登录号 NP416120. 1和AAC74674. 1 ；也可参见中国专利ZL94194707)，。然而，在天然的微生物基因组中，编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基的多核苷酸位于编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基的多核苷酸的上游。另外，该酶变体的研究却没有报道。本专利技术人经过长期艰苦研究，令人意外地发现了以非天然顺序编码吡啶核苷酸转氢酶，仍旧能够表达出具有活性的吡啶核苷酸转氢酶，另外，本专利技术人还发现了新的吡啶核苷酸转氢酶，其显著提高了相应酶的活性，在导入工程菌发酵的时候也获得了更高的赖氨酸产量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供L-赖氨酸的发酵方法，其包括将编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶，其中所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基和吡啶核苷酸转氢酶α亚基。 另外，本专利技术还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等具体而言，在第一方面，本专利技术提供了 L-赖氨酸的发酵方法，其包括(1)将编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶，其中所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基和吡啶核苷酸转氢酶α亚基；和(2)在发酵条件下培养步骤(1)获得的菌。由于通常认为直接顺序串联的两个开放阅读框(ORF)的后一个表达量较低，而本专利技术中又是以吡啶核苷酸转氢酶β亚基和吡啶核苷酸转氢酶α亚基这两个开放阅读框(ORF)直接顺序串联，是非天然的串联形式，因此是否能将表达产物顺利组装成有活性的吡啶核苷酸转氢酶，无法事前预料。而本专利技术人发现，即使使用此非天然的顺序，仍旧能够表达出有活性的吡啶核苷酸转氢酶，用于L-赖氨酸的发酵。其中，吡啶核苷酸转氢酶可以是野生型吡啶核苷酸转氢酶，也可以是其β亚基变体和/或α亚基变体形成的吡啶核苷酸转氢酶变体。野生型吡啶核苷酸转氢酶是本领域技术人员所知晓的，包括α亚基和β亚基，其中α亚基和β亚基的序列分别如 NCBI(http://www. ncbi.nlm.nih. gov)蛋白和基因登录号NP416120. 1 和 AAC74674. 1 所示。然而优选本专利技术第一方面的发酵方法中，吡啶核苷酸转氢酶是吡啶核苷酸转氢酶变体，尤其是相对于野生型吡啶核苷酸转氢酶的活性提高的吡啶核苷酸转氢酶变体。因此， 优选本专利技术第一方面的发酵方法中，所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体，优选其中所述多核苷酸编码的吡啶核苷酸转氢酶变体相对于野生型吡啶核苷酸转氢酶的活性提高，最优选其核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所示。 酶活性的测定方法是现有已知的，如可以采用本专利技术具体实施方式中所述的方法来测定酶活性，这样就可以确认吡啶核苷酸转氢酶变体的活性是否有提高。优选本专利技术第一方面的发酵方法中，所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶α 亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体，即编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的多核苷酸位于编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体的多核苷酸的上游。在本专利技术的具体实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所示。其中，所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体在Α398或D400的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自A398S和D400H，最优选其氨基酸序列如SEQID No :2所示。本领域技术人员可以根据吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本专利技术的具体实施方式中，所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体由如SEQ ID No :3所示的多核苷酸编码。另外，其中所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体在Μ102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自M102L、L127R和Q322K，最优选其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。本领域技术人员可以根据吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本专利技术的具体实施方式中，所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体由如SEQ ID No :5所示的多核苷酸编码。所述多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入产L-赖氨酸的菌，只要能够使产L-赖氨酸的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶变体即可。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。通常，由于产L-赖氨酸的菌本身不适于作为克隆宿主菌，因此优选所述多核苷酸是通过穿梭质粒导入产L-赖氨酸的菌的。其中，所述穿梭质粒优选是大肠杆菌和产L-赖氨酸的菌的穿梭质粒。这样便能够很方便地在大肠杆菌宿主中进行DNA重组操作。产L-赖氨酸的菌有许多种，本领域技术人员所知晓的包括埃希氏杆菌、棒状杆菌和沙雷氏杆菌，优选是棒状杆菌。在本专利技术的具体实施方式中，所述产L-赖氨酸的菌是Corynebacterium glutamicum。优选本专利技术第一方面的发酵方法中，所述发酵条件的发酵温度为观_351，优选为 29-33 0C，更优选为 30-32 0C，如 30 °C。也优选本专利技术第一方面的发酵方法中，所述发酵条件的培养基包含糖，NH4Cl, CaCl2,KH2PO4，蛋白胨，MgSO4,FeSO4,MnSO4，生物素，和叶酸。在本专利技术的具体实施方式中，所述培养基的配方为:40g蔗糖，20g NH4Cl, 2g CaCl2, IgKH2PO4, Ig蛋白胨，5OOmg MgSO4 ·7Η20， 15mg FeSO4 ·7Η20，IOmgMnSO4 ·7Η20，200 μ g 生物素，和 50 μ g 叶酸，ρΗ7· 3，用水补足至 1 升。在第二方面，本专利技术提供了 L-赖氨酸饲料添加剂的制备方法，其包括(1)实施本专利技术第一方面的发酵方法中的步骤O)；和(2)收集发酵液依次进行膜分离并对滤液进行喷雾干燥；(3)对步骤(2)喷雾干燥获得的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．Ｌ－赖氨酸的发酵方法，其包括：（１）将编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸导入产Ｌ－赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶，其中所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基和吡啶核苷酸转氢酶α亚基；和（２）在发酵条件下培养步骤（１）获得的菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马吉银，陈崇安，孟刚，曹洪，程耀东，刘鑫，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：64
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