赖氨酸的流加发酵制备制造技术

本发明专利技术提供了流加发酵L-赖氨酸的方法，其包括将表达吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌接入第一发酵罐于培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，然后向第二发酵罐持续流加糖，之后再向第二发酵罐持续流加糖和氮源。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于氨基酸发酵领域，具体而言，本专利技术涉及流加发酵L-赖氨酸的方法， 其包括将表达吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌接入第一发酵罐于培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，然后向第二发酵罐持续流加糖，之后再向第二发酵罐持续流加糖和氮源。另外，本专利技术还提供了所述方法生产的产品等。
技术介绍
L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。吡啶核苷酸转氢酶是L-赖氨酸代谢途径上重要的酶。尽管野生型吡啶核苷酸转氢酶的亚基已经被公开(可参见NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih. gov)蛋白和基因登录号 NP416120. 1和AAC74674. 1 ；也可参见中国专利ZL94194707)，但是该酶变体的研究却没有报道。本专利技术人经过长期艰苦研究，除了令人意外地发现了新的显著提高酶活性的吡啶核苷酸转氢酶之外，本专利技术人更详细地研究了适合含有该酶的工程菌发酵的方法，在实际生产中增加了赖氨酸的产量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的流加发酵L-赖氨酸的方法，其包括将包括将表达吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌接入第一发酵罐于培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，然后向第二发酵罐持续流加糖，之后再向第二发酵罐持续流加糖和氮源。另外，本专利技术还提供了所述方法生产的产品等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了持续流加发酵L-赖氨酸的方法，其包括(1)将表达吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌接入第一发酵罐于31-38°C培养 10-20小时，其中所述吡啶核苷酸转氢酶变体相对于野生型吡啶核苷酸转氢酶的活性提尚；(2)将步骤(1)获得的培养液以3-7% (体积)的接种量接种于第二发酵罐，于 36-40°C培养3-8小时；(3)向第二发酵罐持续流加糖，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量 m 0. 2-0. 35% (重量)，进行10-18小时；和(4)向第二发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0. 3-0.5% (重量)，而且氮源的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0. 1-0. 25% (重量)，进行30-65小时，优选50-55小时。在本文中，“第一”和“第二”在修饰发酵罐的时候，是为了区分所修饰的发酵罐，即第一发酵罐和第二发酵罐是不同的。在本文中，接种量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以体积百分比表示的时候，指的是菌体培养液(接入的菌液)体积相对于被接入的培养基体积的百分比量。优选在本专利技术第一方面的方法中，第一发酵罐中的培养基配方为每18立方米培养基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米浆400-600公斤，KH2PO4 30-80 公斤，MgSO4 · 7H20 3-15 公斤，FeSO4 · 7H20 0. 1-1 公斤，MnSO4 · 7H20 0. 1-1 公斤，生物素 5-30克，和叶酸3-10克。在本专利技术的具体实施方式中，第一发酵罐中的培养基配方为每 18立方米培养基中含，葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米浆520公斤，KH2PO4 45公斤，MgSO4 · 7H20 7 公斤，FeSO4 · 7H20 0. 5 公斤，MnSO4 · 7H20 0. 5 公斤，生物素 12 克，和叶酸5克。优选在本专利技术第一方面的方法中，第二发酵罐的培养基配方为每315立方米培养基中含，葡萄糖10000-15000公斤，甘蔗糖蜜50-3000公斤，玉米浆10000-15000公斤， KH2PO4 700-1200 公斤，MgSO4 · 7H20 5-220 公斤，FeSO4 · 7H205_25 公斤，MnSO4 · 7H20 5-220 公斤，生物素150-300克，和叶酸50-120克。在本专利技术的具体实施方式中，第二发酵罐的培养基配方为每315立方米培养基中含，葡萄糖12000公斤，甘蔗糖蜜1000公斤，玉米浆 12000 公斤，KH2PO4 1000 公斤，MgSO4 · 7H20 100 公斤，FeSO4 · 7H20 12，MnSO4 · 7H20 120 公斤，生物素200克，和叶酸85克。步骤(3)和(4)的部分培养条件(如，温度，pH等)与步骤O)的可以相同也可以不同。优选步骤⑶和⑷中的温度与步骤O)中的温度相同，即均为36-40°C，优选均为38-39°C。步骤O)中，不进行流加操作；而在步骤(3)和中，pH维持在6. 5至7. 8 之间，这可以简单地通过流加碱或酸来实现。在本文中，流加量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以重量百分比表示的时候，指的是加入物质的重量占被加入物质(如，培养液)的重量的百分比量。优选在本专利技术第一方面的方法中，步骤C3)和中的糖是葡萄糖。在步骤(3)中，葡萄糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.2-0. 35% (重量)，优选为0.27-0. 33% (重量)。在步骤中，葡萄糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.3-0. 5% (重量)，优选为0.42-0. 48% (重量)。优选在本专利技术第一方面的方法中，步骤中的氮源是无机氮源，优选是硫酸铵或氯化铵，如硫酸铵。在步骤中，硫酸铵的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的 0. 1-0. 25% (重量)，优选为 0. 17-0. 23% (重量)。在本专利技术中，野生型吡啶核苷酸转氢酶是本领域技术人员所知晓的，包括α亚基和β亚基，其中α亚基和β亚基的序列分别如NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov)蛋白和基因登录号NP416120. 1和AAC74674. 1所示。酶活性的测定方法是现有已知的，如可以采用本专利技术具体实施方式中所述的方法来测定酶活性，这样就可以确认吡啶核苷酸转氢酶变体的活性是否有提高。优选本专利技术第一方面的方法中，所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体，即编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的多核苷酸位于编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体的多核苷酸的上游。在本专利技术的具体实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所示。其中，所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体在Μ102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自M102L、L127R和Q322K，最优选其氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示。本领域技术人员可以根据吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本专利技术的具体实施方式中，所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体由如SEQ ID No:3 所示的多核苷酸编码。另外，其中所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体在Α398或D400的位置上被其本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．流加发酵Ｌ－赖氨酸的方法，其包括：（１）将表达吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌接入第一发酵罐于３１－３８℃培养１０－２０小时，其中所述吡啶核苷酸转氢酶变体相对于野生型吡啶核苷酸转氢酶的活性提高；（２）将步骤（１）获得的培养液以３－７％（体积）的接种量接种于第二发酵罐，于３６－４０℃培养３－８小时；（３）向第二发酵罐持续流加糖，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的０．２－０．３５％（重量），进行１０－１８小时；和（４）向第二发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的０．３－０．５％（重量），而且氮源的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的０．１－０．２５％（重量），进行３０－６５小时，优选５０－５５小时。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马吉银，陈崇安，孟刚，曹洪，程耀东，刘鑫，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：64